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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 遇到大难题~~~
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)

[交流] 遇到大难题~~~

本人现在从基因组上P一个基因，最初摸索的退火温度为58度，后来做大PCR体系，回收连T载体，筛选菌落做菌落PCR,同时还做了单引物验证，电泳结果显示：只添加了下游引物的PCR跟添加了上下游引物的PCR结果一样，均得到了一样大小的目的片段。。。
    于是老师让我继续优化PCR体系与条件，昨天做了个梯度PCR，做了5个梯度，退火温度分别为55、56、57、58、59，电泳后结果发现55、56有条带，而57~59均没有。。。。。现在都不知道怎么做，还有，我的PCR结果非特异性条带很多。。。。  
附上图片以说明问题，等待高手的指引。。。。
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1楼 2009-09-29 09:06:40
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-9-30 12:43:
我觉得你55和56度P出来的目的条带也是不可信的，因为杂带太多且你的目的片段的不是很亮。其实你做梯度PCR从55-59结果不会有很大的差别的。你的同源臂有多长，也可能是模板浓度太高了。不知道你100的PCR体系加了多 ...

我的同源臂设计的是2KB，我做的PCR体系是15ul的，模板加的是稀释了10倍的基因组DNA。。
   今天做了了个稀释10倍、50倍、100倍、150倍、500倍，结果发现稀释了50倍跟100倍的电泳结果中非特异性条带明显减少了，但是稀释了10倍的电泳结果非特异性条带也少了，这个明显跟我之前做的有很大的不同。。。
  唉，PCR这东西就这么不稳定这么难说明问题吗？？？
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12楼2009-09-30 14:21:16
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
对图说明下：这个是梯度PCR的结果，从右至左分别为：MARKER，退火温度为55度的PCR结果，56度的PCR结果，57度的PCR结果，58度的PCR结果，59度的PCR结果
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2楼2009-09-29 09:10:08
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
MARKER从下至上分别为300bp、500bp、800bp、1000bp、1500bp、2000bp、3000bp、5000bp，我的目的条带为2000bp左右。。。。
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3楼2009-09-29 09:11:27
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huanshi

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2,VIP+0): 9-30 12:46
非特异性条带多可以考虑降落式PCR，不过你的退火温度较高后没有目的条带，所以估计也不行。。

建议：重新设计引物。。

[ Last edited by huanshi on 2009-9-29 at 09:42 ]
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4楼2009-09-29 09:40:55
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