北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)

[交流] 遇到大难题~~~

本人现在从基因组上P一个基因,最初摸索的退火温度为58度,后来做大PCR体系,回收连T载体,筛选菌落做菌落PCR,同时还做了单引物验证,电泳结果显示:只添加了下游引物的PCR跟添加了上下游引物的PCR结果一样,均得到了一样大小的目的片段。。。
    于是老师让我继续优化PCR体系与条件,昨天做了个梯度PCR,做了5个梯度,退火温度分别为55、56、57、58、59,电泳后结果发现55、56有条带,而57~59均没有。。。。。现在都不知道怎么做,还有,我的PCR结果非特异性条带很多。。。。  
附上图片以说明问题,等待高手的指引。。。。
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
pcr特异性这么差,不知道你模板基因组DNA的完整性怎么样?模板的用量如何?
Thank-you,so-blue.
6楼2009-09-29 13:58:35
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)

对图说明下:这个是梯度PCR的结果,从右至左分别为:MARKER,退火温度为55度的PCR结果,56度的PCR结果,57度的PCR结果,58度的PCR结果,59度的PCR结果
2楼2009-09-29 09:10:08
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)

MARKER从下至上分别为300bp、500bp、800bp、1000bp、1500bp、2000bp、3000bp、5000bp,我的目的条带为2000bp左右。。。。
3楼2009-09-29 09:11:27
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huanshi

银虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2,VIP+0): 9-30 12:46
非特异性条带多可以考虑降落式PCR,不过你的退火温度较高后没有目的条带,所以估计也不行。。

建议:重新设计引物。。

[ Last edited by huanshi on 2009-9-29 at 09:42 ]
4楼2009-09-29 09:40:55
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