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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 核酸酶切请达人指教
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000zgh000

新虫 (小有名气)

[交流] 核酸酶切请达人指教

我用HindIII和KPNI进行双酶切，体系如下
10  M buffer                      1uL
质粒                   5uL
双蒸水                 3uL
HindIII（10U/uL)              0.5 uL
KPNI（10U/uL)                0.5 uL


总共 10uL，4小时电泳发现有一条酶切条带，本以为是没切好，7小时候再跑电泳，什么都没有啦，不知道是怎么回事？请高人指点！！！急急急！！！！

[ Last edited by amisking on 2009-9-24 at 21:17 ]
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1楼 2009-09-24 21:05:08
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
这两种酶在质粒上有几个酶切位点？4小时的时候应该有几条带？
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2楼2009-09-24 21:21:57
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000zgh000

新虫 (小有名气)
各有一个酶切位点，条带应该在5000和2500处各有一条，奇怪的是在1000处有一条，7小时后再跑电泳全成了涂片，不知道什么原因，非常着急！！！！
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3楼2009-09-24 21:26:46
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看你的体系及条带应该是验证质粒的吧？你还是切那么多质粒，把体系扩大到20ul，两种酶均用1ul，37度两小时试试。
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4楼2009-09-24 21:46:40
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anik

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1、将质粒的量减少，做20ul体系。
2。你做的那两个需要分步酶切，Kpn 比较特殊，这就是你为什么切不开的原因！
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5楼2009-09-25 08:16:30
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你用的是哪个公司的酶，如果是NEB的话，buffer请用 NEB2 + BSA，我一直用这两个酶切，没有问题啊，质粒少点400ng就足够电泳的了，体系最好用20微升的
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2009-09-25 20:04:26
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
哥们儿，你的质粒用什么提的？用分氯仿抽了么？
某些菌里面的DNA内切酶很多的，37°一会就把DNA给搞定了……
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小木虫之有关部门负责人
7楼2009-10-09 14:00:49
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