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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切连接构建载体一直连接不上
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Milkttttea

新虫 (初入文坛)

[交流] 酶切连接构建载体一直连接不上

切入DNA片段1385bp，载体4729bp

跑胶看亮度，片段大概10ng/ul，载体大概40ng/ul

片段加了15ul，载体2ul，buffer2ul，T4连接酶1ul，摩尔比大概1:6.5。

为什么一直连接不上呢？amp板上一个单克隆都没有

卡在这个实验已经一个月多了真的头秃了！

求帮助！

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青椒之路

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1楼2022-08-07 11:00:48
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Milkttttea

新虫 (初入文坛)
连接酶用的是takara家的

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2楼2022-08-07 11:04:02
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司静Jing.

铁虫 (初入文坛)
★
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DNA片段质量不好吧（浓度 纯度）
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3楼2022-08-08 18:23:18
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Milkttttea

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 司静Jing. at 2022-08-08 18:23:18
DNA片段质量不好吧（浓度 纯度）

昨天又做了两板，载体53.2ng/ul，片段15.7ng/ul，仪器测得浓度，OD260/280都有1.8。1:3比例做了10体系，1:7做了20体系，都没有长单克隆，我真的好迷茫啊，到底问题出在哪里了

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4楼2022-08-10 09:37:30
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tjj451679479

新虫 (小有名气)
★
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酶切位点是否确认过，抗性是否确认过，实在不行重新把片段准备一下（可以测个序看看）
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5楼2022-08-11 11:42:12
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Milkttttea

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by tjj451679479 at 2022-08-11 11:42:12
酶切位点是否确认过，抗性是否确认过，实在不行重新把片段准备一下（可以测个序看看）

载体和片段都是用的同样两个酶进行酶切的，载体质粒amp抗性，也用同样的抗性板转化感受态过

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6楼2022-08-11 14:53:17
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Milkttttea

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by tjj451679479 at 2022-08-11 11:42:12
酶切位点是否确认过，抗性是否确认过，实在不行重新把片段准备一下（可以测个序看看）

片段是转ta克隆再酶切的，酶切下来是两条带，载体和片段。不过我想起当时切目的载体质粒的时候，大概没切完全，有三条带，就是除了载体和两酶切位点片段以外还有条完整质粒的带，但我当时就直接切了载体的带回收了

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7楼2022-08-11 14:57:49
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青椒之路

铜虫 (正式写手)
★
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这个应该不难吧，可能还是配比的问题
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8楼2022-08-16 10:42:33
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Milkttttea

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 青椒之路 at 2022-08-16 10:42:33
这个应该不难吧，可能还是配比的问题

1:3，1:6，1:7，1:9都做过了…现在换无缝克隆试一下了。

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9楼2022-08-18 01:42:22
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Milkttttea

新虫 (初入文坛)
对了我想问一下我只是插入一段蛋白基因不是做融合蛋白的话，是不是就不用考虑移码突变这些问题呀

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10楼2022-08-18 01:43:07
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