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Milkttttea

新虫 (初入文坛)

[交流] 酶切连接构建载体一直连接不上

切入DNA片段1385bp,载体4729bp

跑胶看亮度,片段大概10ng/ul,载体大概40ng/ul

片段加了15ul,载体2ul,buffer2ul,T4连接酶1ul,摩尔比大概1:6.5。

为什么一直连接不上呢?amp板上一个单克隆都没有

卡在这个实验已经一个月多了真的头秃了!

求帮助!

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司静Jing.

铁虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
DNA片段质量不好吧(浓度 纯度)
3楼2022-08-08 18:23:18
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Milkttttea

新虫 (初入文坛)

2楼2022-08-07 11:04:02
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Milkttttea

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 司静Jing. at 2022-08-08 18:23:18
DNA片段质量不好吧(浓度 纯度)

昨天又做了两板,载体53.2ng/ul,片段15.7ng/ul,仪器测得浓度,OD260/280都有1.8。1:3比例做了10体系,1:7做了20体系,都没有长单克隆,我真的好迷茫啊,到底问题出在哪里了

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4楼2022-08-10 09:37:30
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tjj451679479

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
酶切位点是否确认过,抗性是否确认过,实在不行重新把片段准备一下(可以测个序看看)
5楼2022-08-11 11:42:12
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