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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 最近在做毕赤酵母蛋白诱导，总是失败，想请个好心人帮帮忙，谢谢了
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fbcjm

新虫 (小有名气)

[交流] 最近在做毕赤酵母蛋白诱导，总是失败，想请个好心人帮帮忙，谢谢了 已有4人参与

老师让做毕赤酵母，电转总是长不出来，有很多问题，希望有好心人可以帮帮忙。

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1楼 2022-07-09 09:37:25
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biosci

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毕赤酵母我是专家，联系我吧

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2楼2022-07-09 10:38:14
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abcjlm

铜虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by fbcjm at 2022-07-21 12:44:35
看了，大致流程就是水洗三次，山梨醇洗三次，然后与线性化质粒一起电转，电压是1500，涂的缺HIS板
...

线性化回收后质粒的浓度是多少（电转的质粒浓度要控制好）     有没有空白对照 （9k原始质粒）      电转杯和山梨醇也要2-8度预冷    全程低温操作   
买的培养基用X33做阳性对照了吗    水浴的时候 有每隔一段时间上下颠倒混匀吗 （影响不大）   涂板前从混匀的原液中取个20ul转入YPD中过夜培养 后再取一部分放入含有遗传霉素的YPD 培养（如果能长出来，实在不行都可以用这个划线挑单克隆）
这些对照就可以看出到底问题出在哪一步
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fbcjm
8楼2022-07-22 09:24:45
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abcjlm

铜虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by fbcjm at 2022-07-22 22:56:20
浓度是三十多ng/μI；用了二十多微升，确实有点低，我抱着侥幸心理了。因为我想如果正常的话，应该不会一个也不长吧。
老师只是给了我一些构建好的质粒进行转化，让我试试。
山梨醇水洗和四度离心的时候离心管会短 ...

目前看来你是质粒浓度达不到（质粒浓度低，也会影响拷贝数 ）    你最好做一个空载质粒对照  要不然找原因就很盲目  你的后面操作应该没问题   对于酵母来说质粒的电转效率就很高    用9k质粒你是要后面筛选多拷贝的  所以你要尽可能多的获得转化子
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10楼2022-07-25 10:36:03
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abcjlm

铜虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by fbcjm at 2022-07-22 22:56:20
浓度是三十多ng/μI；用了二十多微升，确实有点低，我抱着侥幸心理了。因为我想如果正常的话，应该不会一个也不长吧。
老师只是给了我一些构建好的质粒进行转化，让我试试。
山梨醇水洗和四度离心的时候离心管会短 ...

https://www.thermofisher.cn/cn/z ... etting-started.html
没事的时候 看看这个
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11楼2022-07-25 11:05:38
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fbcjm

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by biosci at 2022-07-09 10:38:14
毕赤酵母我是专家，联系我吧

太谢谢了，我先大概说一下我的步骤吧。
我现在转的酵母是GS115，载体是Ppic9k，SacI酶切。下面是酶切跑胶对照图片。
酵母感受态的制备就是四度下水洗，山梨醇各洗三次。做了几次了，也有现做现转的，也有放在负八十保存后再转的。

电压1500，2000都试过，是艾本德的电转仪。电转后加入1ML山梨醇，30℃水浴两小时涂板。

涂的板是缺HIS板。
就是这瓶和葡萄糖加琼脂A配成的培养基。
最近在做毕赤酵母蛋白诱导，总是失败，想请个好心人帮帮忙，谢谢了


最近在做毕赤酵母蛋白诱导，总是失败，想请个好心人帮帮忙，谢谢了-1



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3楼2022-07-09 16:13:45
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abcjlm

铜虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by fbcjm at 2022-07-09 16:13:45
太谢谢了，我先大概说一下我的步骤吧。
我现在转的酵母是GS115，载体是Ppic9k，SacI酶切。下面是酶切跑胶对照图片。
酵母感受态的制备就是四度下水洗，山梨醇各洗三次。做了几次了，也有现做现转的，也有放在负八十 ...

现在弄好了吗
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4楼2022-07-15 15:29:06
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fbcjm

新虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by abcjlm at 2022-07-15 15:29:06
现在弄好了吗...

没，有点绝望

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5楼2022-07-18 15:13:41
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abcjlm

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5楼: Originally posted by fbcjm at 2022-07-18 15:13:41
没，有点绝望
...

你看了毕赤酵母表达手册了吗
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6楼2022-07-19 17:19:42
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fbcjm

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6楼: Originally posted by abcjlm at 2022-07-19 17:19:42
你看了毕赤酵母表达手册了吗...

看了，大致流程就是水洗三次，山梨醇洗三次，然后与线性化质粒一起电转，电压是1500，涂的缺HIS板

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7楼2022-07-21 12:44:35
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fbcjm

新虫 (小有名气)
送红花一朵
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8楼: Originally posted by abcjlm at 2022-07-22 09:24:45
线性化回收后质粒的浓度是多少（电转的质粒浓度要控制好）     有没有空白对照 （9k原始质粒）      电转杯和山梨醇也要2-8度预冷    全程低温操作   
买的培养基用X33做阳性对照了吗    水浴的时候 有每隔一段时 ...

浓度是三十多ng/μI；用了二十多微升，确实有点低，我抱着侥幸心理了。因为我想如果正常的话，应该不会一个也不长吧。
老师只是给了我一些构建好的质粒进行转化，让我试试。
山梨醇水洗和四度离心的时候离心管会短暂拿出冰盒。电击杯还真没有预冷，混匀菌液和质粒后，会在冰上预冷一下。
板应该没问题，因为实验室里有构建好的KM71菌，在板上可以正常生长。
电击后加入山梨醇了就可以水浴涂板了吗

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乌克兰跑男
9楼2022-07-22 22:56:20
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