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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 最近在做毕赤酵母蛋白诱导，总是失败，想请个好心人帮帮忙，谢谢了
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fbcjm

新虫 (小有名气)

[交流] 最近在做毕赤酵母蛋白诱导，总是失败，想请个好心人帮帮忙，谢谢了 已有4人参与

老师让做毕赤酵母，电转总是长不出来，有很多问题，希望有好心人可以帮帮忙。

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1楼 2022-07-09 09:37:25
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abcjlm

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by fbcjm at 2022-07-21 12:44:35
看了，大致流程就是水洗三次，山梨醇洗三次，然后与线性化质粒一起电转，电压是1500，涂的缺HIS板
...

线性化回收后质粒的浓度是多少（电转的质粒浓度要控制好）     有没有空白对照 （9k原始质粒）      电转杯和山梨醇也要2-8度预冷    全程低温操作   
买的培养基用X33做阳性对照了吗    水浴的时候 有每隔一段时间上下颠倒混匀吗 （影响不大）   涂板前从混匀的原液中取个20ul转入YPD中过夜培养 后再取一部分放入含有遗传霉素的YPD 培养（如果能长出来，实在不行都可以用这个划线挑单克隆）
这些对照就可以看出到底问题出在哪一步
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fbcjm
8楼2022-07-22 09:24:45
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
毕赤酵母我是专家，联系我吧

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2楼2022-07-09 10:38:14
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fbcjm

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biosci at 2022-07-09 10:38:14
毕赤酵母我是专家，联系我吧

太谢谢了，我先大概说一下我的步骤吧。
我现在转的酵母是GS115，载体是Ppic9k，SacI酶切。下面是酶切跑胶对照图片。
酵母感受态的制备就是四度下水洗，山梨醇各洗三次。做了几次了，也有现做现转的，也有放在负八十保存后再转的。

电压1500，2000都试过，是艾本德的电转仪。电转后加入1ML山梨醇，30℃水浴两小时涂板。

涂的板是缺HIS板。
就是这瓶和葡萄糖加琼脂A配成的培养基。
最近在做毕赤酵母蛋白诱导，总是失败，想请个好心人帮帮忙，谢谢了


最近在做毕赤酵母蛋白诱导，总是失败，想请个好心人帮帮忙，谢谢了-1



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3楼2022-07-09 16:13:45
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abcjlm

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by fbcjm at 2022-07-09 16:13:45
太谢谢了，我先大概说一下我的步骤吧。
我现在转的酵母是GS115，载体是Ppic9k，SacI酶切。下面是酶切跑胶对照图片。
酵母感受态的制备就是四度下水洗，山梨醇各洗三次。做了几次了，也有现做现转的，也有放在负八十 ...

现在弄好了吗
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4楼2022-07-15 15:29:06
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