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fbcjm

新虫 (小有名气)

[交流] 最近在做毕赤酵母蛋白诱导,总是失败,想请个好心人帮帮忙,谢谢了 已有4人参与

老师让做毕赤酵母,电转总是长不出来,有很多问题,希望有好心人可以帮帮忙。

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abcjlm

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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7楼: Originally posted by fbcjm at 2022-07-21 12:44:35
看了,大致流程就是水洗三次,山梨醇洗三次,然后与线性化质粒一起电转,电压是1500,涂的缺HIS板
...

线性化回收后质粒的浓度是多少(电转的质粒浓度要控制好)     有没有空白对照 (9k原始质粒)      电转杯和山梨醇也要2-8度预冷    全程低温操作   
买的培养基用X33做阳性对照了吗    水浴的时候 有每隔一段时间上下颠倒混匀吗 (影响不大)   涂板前从混匀的原液中取个20ul转入YPD中过夜培养 后再取一部分放入含有遗传霉素的YPD 培养(如果能长出来,实在不行都可以用这个划线挑单克隆)
这些对照就可以看出到底问题出在哪一步

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8楼2022-07-22 09:24:45
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
毕赤酵母我是专家,联系我吧

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2楼2022-07-09 10:38:14
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fbcjm

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by biosci at 2022-07-09 10:38:14
毕赤酵母我是专家,联系我吧

太谢谢了,我先大概说一下我的步骤吧。
我现在转的酵母是GS115,载体是Ppic9k,SacI酶切。下面是酶切跑胶对照图片。
酵母感受态的制备就是四度下水洗,山梨醇各洗三次。做了几次了,也有现做现转的,也有放在负八十保存后再转的。

电压1500,2000都试过,是艾本德的电转仪。电转后加入1ML山梨醇,30℃水浴两小时涂板。

涂的板是缺HIS板。
就是这瓶和葡萄糖加琼脂A配成的培养基。
最近在做毕赤酵母蛋白诱导,总是失败,想请个好心人帮帮忙,谢谢了


最近在做毕赤酵母蛋白诱导,总是失败,想请个好心人帮帮忙,谢谢了-1



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3楼2022-07-09 16:13:45
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abcjlm

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by fbcjm at 2022-07-09 16:13:45
太谢谢了,我先大概说一下我的步骤吧。
我现在转的酵母是GS115,载体是Ppic9k,SacI酶切。下面是酶切跑胶对照图片。
酵母感受态的制备就是四度下水洗,山梨醇各洗三次。做了几次了,也有现做现转的,也有放在负八十 ...

现在弄好了吗
4楼2022-07-15 15:29:06
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