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龙猫和阿里

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助于各位老师!过表达蛋白条带异常,过表达条带不与内源重合

各位老师,同门好,我面临的主要问题是,用PCDH(载体图谱如下图1),带有3Flag标签,及T2A元件
构建目的蛋白过表达载体,病毒包装后,经过三天puro药筛,对药筛后得到的细胞进行WB检测,WB结果如下图2,293稳赚细胞株结果显示,过表达条带位于内源条带上方,分子量大小明显大于内源条带,而预测蛋白分子量为70.8kDa, 表达蛋白预测分子量为75.91kDa, 用10%的分离胶会有如此明显差异吗,12%的胶我也跑过,也是明显的两条带。

恳请各位老师,同门指点!

求助于各位老师!过表达蛋白条带异常,过表达条带不与内源重合
图1.jpg


求助于各位老师!过表达蛋白条带异常,过表达条带不与内源重合-1
图2.jpg
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紫莲碧嫣

新虫 (正式写手)

可不可能是因为加了3Flag?它本身也有几KD

发自小木虫Android客户端
2楼2021-10-12 16:58:23
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龙猫和阿里

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 紫莲碧嫣 at 2021-10-12 16:58:23
可不可能是因为加了3Flag?它本身也有几KD

10%的胶,然后分子量在70上,我总觉得5kDa不可能分这么开
3楼2021-10-12 20:19:51
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紫莲碧嫣

新虫 (正式写手)

应该是的,marker也没有那么严格,这么小只能看个大概

发自小木虫Android客户端
4楼2021-10-12 20:43:20
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我不再玩灬

新虫 (小有名气)

可不可以卖你实验室的那个 mt-mKeima 质粒呀
keep in good health, and not die.
5楼2021-10-22 17:03:57
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龙猫和阿里

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 我不再玩灬 at 2021-10-22 17:03:57
可不可以卖你实验室的那个 mt-mKeima 质粒呀

您好,这个得问过老板,才能决定,可以私信留下邮箱,最好是导师的,谢谢!
6楼2021-10-25 10:46:54
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道理明明我都懂

新虫 (著名写手)

这……70kDa大小的蛋白,5kD是怎么做到这么明显的啊?如果真的只相差5kD的话,求WB条件!制胶浓度,转膜时间等等……

发自小木虫Android客户端
7楼2021-11-30 23:44:39
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yishubin90

新虫 (初入文坛)

5kDa已经很大了啊,,1*FLAG都能看见区别,别说3*了
8楼2021-12-23 22:05:17
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