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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助于各位老师！过表达蛋白条带异常，过表达条带不与内源重合
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龙猫和阿里

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助于各位老师！过表达蛋白条带异常，过表达条带不与内源重合

各位老师，同门好，我面临的主要问题是，用PCDH（载体图谱如下图1），带有3Flag标签，及T2A元件
构建目的蛋白过表达载体，病毒包装后，经过三天puro药筛，对药筛后得到的细胞进行WB检测，WB结果如下图2，293稳赚细胞株结果显示，过表达条带位于内源条带上方，分子量大小明显大于内源条带，而预测蛋白分子量为70.8kDa, 表达蛋白预测分子量为75.91kDa, 用10%的分离胶会有如此明显差异吗，12%的胶我也跑过，也是明显的两条带。

恳请各位老师，同门指点！

求助于各位老师！过表达蛋白条带异常，过表达条带不与内源重合
图1.jpg


求助于各位老师！过表达蛋白条带异常，过表达条带不与内源重合-1
图2.jpg
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1楼 2021-10-12 09:41:26
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紫莲碧嫣

新虫 (正式写手)
可不可能是因为加了3Flag？它本身也有几KD

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2楼2021-10-12 16:58:23
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龙猫和阿里

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 紫莲碧嫣 at 2021-10-12 16:58:23
可不可能是因为加了3Flag？它本身也有几KD

10%的胶，然后分子量在70上，我总觉得5kDa不可能分这么开
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3楼2021-10-12 20:19:51
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紫莲碧嫣

新虫 (正式写手)
应该是的，marker也没有那么严格，这么小只能看个大概

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4楼2021-10-12 20:43:20
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我不再玩灬

新虫 (小有名气)
可不可以卖你实验室的那个 mt-mKeima 质粒呀
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keep in good health, and not die.
5楼2021-10-22 17:03:57
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龙猫和阿里

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 我不再玩灬 at 2021-10-22 17:03:57
可不可以卖你实验室的那个 mt-mKeima 质粒呀

您好，这个得问过老板，才能决定，可以私信留下邮箱，最好是导师的，谢谢！
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6楼2021-10-25 10:46:54
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道理明明我都懂

新虫 (著名写手)
这……70kDa大小的蛋白，5kD是怎么做到这么明显的啊？如果真的只相差5kD的话，求WB条件！制胶浓度，转膜时间等等……

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7楼2021-11-30 23:44:39
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yishubin90

新虫 (初入文坛)
5kDa已经很大了啊，，1*FLAG都能看见区别，别说3*了
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8楼2021-12-23 22:05:17
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