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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 农杆菌转化
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求学。

新虫 (初入文坛)

[求助] 农杆菌转化

我是讲载体与目的基因酶切后链接转入大肠杆菌感受态细胞中，摇菌提质粒后双酶切验证条带也没问题，用验证过的质粒采用冻融法转EH105农杆菌，在含卡娜和利福平的平板上培养，长单菌落，挑完摇菌后菌液pcr却没有条带，，重复3次，别人带了一次，别人菌有带我的还是没有，求各位大神帮忙分析一下问题所在，感谢

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1楼 2020-07-13 22:35:08
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木元雨

木虫 (职业作家)
大肠杆菌的那个菌液怎么做的pcr检测呢？

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2楼2020-07-13 23:43:29
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爆炒小木虫

新虫 (小有名气)
你是不是没摇晃

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3楼2020-07-14 01:01:22
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owl2010

金虫 (正式写手)
浓杆菌的细胞壁很厚，挑的菌落摇菌后可以吸取100ul至1.5ml离心管高速离心再加50ul水混匀后80度金属浴10分钟后，用此裂解液模板做PCR。
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男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。
4楼2020-07-14 13:32:26
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yuzhongbaihe

新虫 (正式写手)
要是pcr验证不出来，那你提质粒试试，不过就是麻烦些，要是质粒也提不出来，是不是有可能没转进去？

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5楼2020-07-14 21:00:20
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zhz0809

新虫 (初入文坛)
首先看长菌时间对不对，需要在36-48h之间长起来的才是正确的菌，时间早了完了都是杂菌！其次农杆菌抗性本身容易失效，如果48h只长了不到10个克隆，很可能是杂菌！如果长了100个克隆以上，肯定是转化成功了！

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6楼2020-07-27 22:19:15
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zhz0809

新虫 (初入文坛)
农杆菌有细胞壁菌落PCR比较难，需要选用扩增能力强的taq酶，而且P出来也不会太亮！用质粒小提也可以，提10ml菌液30ul洗脱，10ul电泳可见条带，PCR也容易

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7楼2020-07-27 22:21:37
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匿名

用户注销 (初入文坛)
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8楼2020-08-06 09:34:44
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新艺

新虫 (小有名气)
楼主，您好，请问你们用的农杆菌转化的质粒是哪一个？近期我们也想做农杆菌介导转化，想问一下是否可以交换质粒？购买也可以。我们实验室有真菌转化常用质粒pAN7-1（氨苄和潮霉素抗性）和pCT74（氨苄和潮霉素抗性，有荧光蛋白），其次，还有2个谷氨酸棒状杆菌表达质粒。
我的qq：547709812
邮箱zxy19880920@163.com
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9楼2020-10-08 19:27:49
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