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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 异源表达蛋白遇到问题
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fast-rui

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 张凡云 at 2019-06-12 09:20:44
两个方案，用pGEX4T-1这样的融合表达系统，二是用rosetta这样的宿主菌

好滴，谢谢，我查一下相关资料

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11楼2019-06-12 10:09:11
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Excalibur1

新虫 (小有名气)
★
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试试包涵体复性，或者共表达一个分子伴侣

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12楼2019-06-12 10:39:38
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fast-rui

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by Excalibur1 at 2019-06-12 10:39:38
试试包涵体复性，或者共表达一个分子伴侣

好的呢，谢谢，我也打算这批诱导结束以后包涵体同时复性看看

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13楼2019-06-12 11:32:47
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fast-rui

新虫 (小有名气)
我还想问一下，摇到od以后不是要等菌稍微冷却一点再加iptg嘛，这个等待的时间最长不超过多久合适呢？因为我今天做的对照和一个实验组已经摇到了，对照等了快一个小时了，实验组有20分钟了，但是还有三瓶没摇起来，等它们摇起来我觉得要好久好久。我是先不管它们直接诱导比较好，让那三瓶下次做？

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14楼2019-06-12 17:39:39
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
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对于在温度稍高容易形成包涵体的蛋白质，摇到od以后要等菌液冷却一点再加iptg，因为包涵体的形成有可能形成惯性，一旦开始形成，扭转需要时间。如果不容易形成包涵体的蛋白质，不必降温再诱导。

用BL21容易形成包涵体，用大肠杆菌的其它菌株只能是改善，不会根治，因为同一个物种的折叠系统大同小异。换宿主可能要换物种。

加一段融合蛋白质可能改善但不一定根治，而且不能确定会不会对蛋白质的本身性质有改变。具体要什么样的性质或可以接受什么样的性质，问你导师。

复性不一定可行，因为不一定能完全复性，而且即使部分复性形成可溶蛋白质，其性质也不一定与正确折叠得到的蛋白质性质一致。具体要什么样的性质或可以接受什么样的性质，问你导师。

你把长得快的菌液拿出来放在室温下短时间不会影响菌体状态，最多就是因为接触氧气不足造成生长缓慢。要是你担心，就放在温度稍低的摇床继续摇，大肠杆菌在28度的生长温度约为37度下八分之一。

要是还有能够维持更低温度的摇床，就继续降低温度。大肠杆菌在iptg存在时不会完全停止生长，但在这么低的温度下就更慢。OD600为1.5时诱导，10度。

很低温度时，摇床压力大，或直接走极端，放在4度冰箱时不时拿起来摇一摇。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
15楼2019-06-14 00:40:45
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kindermoon

木虫 (小有名气)
★
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增加可溶性表达可以等OD600大一点比如1.0以上再加IPTG诱导，诱导时间一般2-3小时其实就够了。温度25度或者16度都可以。还是不行的话只能复性（后期处理麻烦还未必能复性成功）或者换别的工程菌试试。如果有少量可溶性的就可以了，大不了多摇几次的事。
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16楼2019-06-14 13:40:23
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a336688

木虫 (小有名气)

追梦
★
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15楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2019-06-14 00:40:45
对于在温度稍高容易形成包涵体的蛋白质，摇到od以后要等菌液冷却一点再加iptg，因为包涵体的形成有可能形成惯性，一旦开始形成，扭转需要时间。如果不容易形成包涵体的蛋白质，不必降温再诱导。

用BL21容易形成包 ...

你说的大多无根据吧，全凭经验不靠谱的，至少很多观点不敢苟同
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17楼2019-06-18 09:01:40
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
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引用回帖:
17楼: Originally posted by a336688 at 2019-06-18 09:01:40
你说的大多无根据吧，全凭经验不靠谱的，至少很多观点不敢苟同...

我是凭经验，当然，同一个实验换个人或者地方做可能有不同结果。不过，能够有经验，就表示首先要有知识，不然连做的资格都没有。另外，我在整个生物医药区几个版块的EPI总和好像是排第二名的2倍？太久不来，不记得了。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
18楼2019-06-18 14:04:11
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fast-rui

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2019-06-14 00:40:45
对于在温度稍高容易形成包涵体的蛋白质，摇到od以后要等菌液冷却一点再加iptg，因为包涵体的形成有可能形成惯性，一旦开始形成，扭转需要时间。如果不容易形成包涵体的蛋白质，不必降温再诱导。

用BL21容易形成包 ...

您好，我还想问一下，我想试一下更低温度的诱导（比如4℃或者10℃），那么OD值应该摇到多少合适？要1.0以上吗？和0.6-0.8有啥区别？
如果要这两个温度诱导的话，是不是诱导时间也不用过夜，2-3h就够了？

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19楼2019-06-25 10:45:40
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