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异源表达蛋白遇到问题 已有8人参与
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本人最近在做异源表达，用的pet28a表达载体，宿主菌是BL21，od摇到0.6-0.8，16℃诱导19h，做了几次蛋白大部分都在包涵体中，iptg浓度试过0.1-0.8mM的。这次打算试试培养基多调几个ph试试。 但是想问就是我的蛋白等电点是6.74，LB的ph会影响表达吗？破碎的时候蛋白裂解液的ph设为多少比较合适？有没有大神可以给我点建议，看看能不能把包涵体减少。 发自小木虫IOS客户端 |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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对于在温度稍高容易形成包涵体的蛋白质，摇到od以后要等菌液冷却一点再加iptg，因为包涵体的形成有可能形成惯性，一旦开始形成，扭转需要时间。如果不容易形成包涵体的蛋白质，不必降温再诱导。 用BL21容易形成包涵体，用大肠杆菌的其它菌株只能是改善，不会根治，因为同一个物种的折叠系统大同小异。换宿主可能要换物种。 加一段融合蛋白质可能改善但不一定根治，而且不能确定会不会对蛋白质的本身性质有改变。具体要什么样的性质或可以接受什么样的性质，问你导师。 复性不一定可行，因为不一定能完全复性，而且即使部分复性形成可溶蛋白质，其性质也不一定与正确折叠得到的蛋白质性质一致。具体要什么样的性质或可以接受什么样的性质，问你导师。 你把长得快的菌液拿出来放在室温下短时间不会影响菌体状态，最多就是因为接触氧气不足造成生长缓慢。要是你担心，就放在温度稍低的摇床继续摇，大肠杆菌在28度的生长温度约为37度下八分之一。 要是还有能够维持更低温度的摇床，就继续降低温度。大肠杆菌在iptg存在时不会完全停止生长，但在这么低的温度下就更慢。OD600为1.5时诱导，10度。 很低温度时，摇床压力大，或直接走极端，放在4度冰箱时不时拿起来摇一摇。 |
15楼2019-06-14 00:40:45
2楼2019-06-11 21:03:08
3楼2019-06-11 22:22:47
4楼2019-06-11 22:44:34