| 查看: 2870 | 回复: 18 | ||||
[交流]
异源表达蛋白遇到问题已有8人参与
|
||||
|
本人最近在做异源表达，用的pet28a表达载体，宿主菌是BL21，od摇到0.6-0.8，16℃诱导19h，做了几次蛋白大部分都在包涵体中，iptg浓度试过0.1-0.8mM的。这次打算试试培养基多调几个ph试试。 但是想问就是我的蛋白等电点是6.74，LB的ph会影响表达吗？破碎的时候蛋白裂解液的ph设为多少比较合适？有没有大神可以给我点建议，看看能不能把包涵体减少。 发自小木虫IOS客户端 |
回复此楼» 猜你喜欢
国家重点实验室基金，通知去答辩。希望大不？
已经有9人回复
-
优青已经开始了么？
已经有6人回复
-
投稿RSC旗下杂志突然间看不到投稿状态，里面投稿的文章信息不见了，有遇到过的吗？
已经有4人回复
-
华南理工大学未来技术学院林镇宏教授“能源与碳决策”课题组招收2024级博士生
已经有3人回复
-
科研压力大，掉头发怎么办
已经有10人回复
-
今年面上预计又打酱油了
已经有9人回复
-
为什么石墨样氮化碳会拍出来这么诡异的TEM照片
已经有13人回复
-
说同学对待毕业论文不认真后她很不悦
已经有8人回复
-
博士后和科研助理好难找啊
已经有11人回复
-
关于公布2024年度国家自然科学基金项目申请初审结果的通告
已经有12人回复
2楼2019-06-11 21:03:08
冼亮淀粉酶
专家顾问 (知名作家)
生物大分子降解酶
-
专家经验: +230 - BioEPI: 72
- 应助: 255 (大学生)
- 贵宾: 0.272
- 金币: 17151
- 散金: 1702
- 红花: 116
- 帖子: 6363
- 在线: 2665.3小时
- 虫号: 856414
- 注册: 2009-09-25
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
- 管辖: 微生物
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
对于在温度稍高容易形成包涵体的蛋白质，摇到od以后要等菌液冷却一点再加iptg，因为包涵体的形成有可能形成惯性，一旦开始形成，扭转需要时间。如果不容易形成包涵体的蛋白质，不必降温再诱导。 用BL21容易形成包涵体，用大肠杆菌的其它菌株只能是改善，不会根治，因为同一个物种的折叠系统大同小异。换宿主可能要换物种。 加一段融合蛋白质可能改善但不一定根治，而且不能确定会不会对蛋白质的本身性质有改变。具体要什么样的性质或可以接受什么样的性质，问你导师。 复性不一定可行，因为不一定能完全复性，而且即使部分复性形成可溶蛋白质，其性质也不一定与正确折叠得到的蛋白质性质一致。具体要什么样的性质或可以接受什么样的性质，问你导师。 你把长得快的菌液拿出来放在室温下短时间不会影响菌体状态，最多就是因为接触氧气不足造成生长缓慢。要是你担心，就放在温度稍低的摇床继续摇，大肠杆菌在28度的生长温度约为37度下八分之一。 要是还有能够维持更低温度的摇床，就继续降低温度。大肠杆菌在iptg存在时不会完全停止生长，但在这么低的温度下就更慢。OD600为1.5时诱导，10度。 很低温度时，摇床压力大，或直接走极端，放在4度冰箱时不时拿起来摇一摇。 |
15楼2019-06-14 00:40:45
kindermoon
木虫 (小有名气)
- 应助: 6 (幼儿园)
- 金币: 6875.6
- 红花: 3
- 帖子: 91
- 在线: 593.4小时
- 虫号: 831472
- 注册: 2009-08-20
- 性别: GG
- 专业: 生物物理化学
16楼2019-06-14 13:40:23
3楼2019-06-11 22:22:47
4楼2019-06-11 22:44:34
5楼2019-06-11 22:45:04
shuiyuan003
新虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 6336.7
- 散金: 20
- 红花: 2
- 帖子: 923
- 在线: 191.7小时
- 虫号: 2359389
- 注册: 2013-03-19
- 专业: 保险学
6楼2019-06-12 01:13:04
7楼2019-06-12 08:33:18
张凡云
至尊木虫 (职业作家)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 13247.4
- 散金: 3013
- 红花: 13
- 帖子: 3945
- 在线: 1452.6小时
- 虫号: 2426111
- 注册: 2013-04-19
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
8楼2019-06-12 09:20:44
9楼2019-06-12 10:08:00
10楼2019-06-12 10:08:49
50