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杨默格

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yougu1314

2楼2018-09-04 11:49:26

balalalabala

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yougu1314(渊博震天代发): 金币+5, 鼓励回帖交流 2018-09-04 15:21:26

我遇到过同样的问题，应该是标签为暴露在蛋白的表面，所以没办法纯化，试试gst融合蛋白表达，还可以试试重折叠，还有硫酸铵沉淀，还有就是把his标签和蛋白的link加长看能不能暴露在外面。

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3楼2018-09-04 12:23:04

allegory

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4楼2018-09-04 16:52:15

yougu1314

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5楼2018-09-05 15:14:43

泡沫12

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可以试一下GST标签的载体

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6楼2018-09-06 21:20:59

maoniuniu

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His标签纯化和阴离子交换柱原理不同，不可同时比较。如果是His标签WB检测正确表达，且上清中量很大，可溶性很高，同时纯化步骤有对照，排除了柱料失效的问题，确实可以考虑标签是否暴露充分的问题，但是如果是标签暴露不充分，理论上换别的标签也是同样的问题，GST和MBP这些标签可帮助蛋白折叠，提高可溶性，但无法解决标签暴露问题，可以考虑改变标签的融合位置，比如N或C，加长linker也是优先选择的方法，甚至在充分了解蛋白结构的前提下可考虑加在一级结构的内部。如果阴离子交换不挂柱，同样在排除前述问题后，包括你蛋白表达没问题，你柱子没问题，那么要考虑使用的阴离子柱类型是否合适，这种纯化方式与你的标签暴露与否没有太直接的关系

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yougu1314

7楼2018-09-07 09:55:17

maoniuniu

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对了，像楼上说重折叠也是可以的，即在尿素或盐酸胍变性的前提下进行纯化，GE的镍柱都是支持变性条件下纯化的，但是这种纯化方式不推荐优先选择，实在没办法才会去做，因为变性后的复性是个很麻烦的事，除非你不需要有活性的蛋白，可以不用考虑复性，只要可溶就行。另，硫酸铵沉淀一般用在最开始对目标蛋白进行粗分离，粗沉淀，最后仍然是绕不开后续亲和纯化的

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8楼2018-09-07 10:01:11