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yougu1314

禁虫 (小有名气)

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杨默格

禁虫 (正式写手)


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2楼2018-09-04 11:49:26
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balalalabala

新虫 (小有名气)

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yougu1314(渊博震天代发): 金币+5, 鼓励回帖交流 2018-09-04 15:21:26
我遇到过同样的问题,应该是标签为暴露在蛋白的表面,所以没办法纯化,试试gst融合蛋白表达,还可以试试重折叠,还有硫酸铵沉淀,还有就是把his标签和蛋白的link加长看能不能暴露在外面。

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3楼2018-09-04 12:23:04
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allegory

禁虫 (著名写手)


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4楼2018-09-04 16:52:15
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yougu1314

禁虫 (小有名气)

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5楼2018-09-05 15:14:43
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泡沫12

新虫 (小有名气)


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可以试一下GST标签的载体

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6楼2018-09-06 21:20:59
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maoniuniu

新虫 (小有名气)


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His标签纯化和阴离子交换柱原理不同,不可同时比较。如果是His标签WB检测正确表达,且上清中量很大,可溶性很高,同时纯化步骤有对照,排除了柱料失效的问题,确实可以考虑标签是否暴露充分的问题,但是如果是标签暴露不充分,理论上换别的标签也是同样的问题,GST和MBP这些标签可帮助蛋白折叠,提高可溶性,但无法解决标签暴露问题,可以考虑改变标签的融合位置,比如N或C,加长linker也是优先选择的方法,甚至在充分了解蛋白结构的前提下可考虑加在一级结构的内部。如果阴离子交换不挂柱,同样在排除前述问题后,包括你蛋白表达没问题,你柱子没问题,那么要考虑使用的阴离子柱类型是否合适,这种纯化方式与你的标签暴露与否没有太直接的关系

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7楼2018-09-07 09:55:17
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maoniuniu

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对了,像楼上说重折叠也是可以的,即在尿素或盐酸胍变性的前提下进行纯化,GE的镍柱都是支持变性条件下纯化的,但是这种纯化方式不推荐优先选择,实在没办法才会去做,因为变性后的复性是个很麻烦的事,除非你不需要有活性的蛋白,可以不用考虑复性,只要可溶就行。另,硫酸铵沉淀一般用在最开始对目标蛋白进行粗分离,粗沉淀,最后仍然是绕不开后续亲和纯化的

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8楼2018-09-07 10:01:11
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gfc7758

禁虫 (初入文坛)


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9楼2018-09-07 16:27:31
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yougu1314

禁虫 (小有名气)

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10楼2018-09-07 22:28:15
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