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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建重组质粒屡次失败
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快乐是选择

新虫 (初入文坛)

[交流] 构建重组质粒屡次失败 已有15人参与

构建重组质粒，经快速验证重组质粒比空质粒还要小，是什么情况，一直找不到原因，我就空质粒也进行了酶切，没有问题。
现在构建质粒四个月了，一直构建不出来，构建出来一个也是全凭运气！

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1楼 2018-08-30 10:25:49
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
★
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按照我的经验是，酶切后的质粒浓度一定要高，怎么提高回收浓度呢？那就是多酶切几管，合并回收，之后用65℃加热的灭菌水冲洗
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8楼2018-08-31 08:57:57
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快乐是选择

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by macgray11 at 2018-08-30 11:09:35
把你的实验详细说明一下，可以帮你分析看看

载体6000bp左右，目的片段1700bp左右，酶切EcoRI、BamHI，酶切量50ng，各切8管回收。往往酶切载体和目的片段浓度都不算高，不超过10ng/ul。T4连接5小时，有时12小时。转化TOP10中，LB+Em 37℃培养24小时，挑菌快速验证，质粒有的与空质粒大小一样，有的比空质粒小。经酶切验证，有一个质粒酶切出两条带，但大小与实际不符。
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10楼2018-08-31 21:16:09
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普通回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)
丢给我嘛。。。很快滴。。。
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2楼2018-08-30 11:03:31
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macgray11

禁虫 (小有名气)
★
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3楼2018-08-30 11:09:35
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白话八股

金虫 (正式写手)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:16:58
详细步骤说一下，不行换个酶切位点或者改下实验方案

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最爱的那个人会出现在身边。
4楼2018-08-30 12:09:51
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墨秦墨秦

银虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:17:11
有没有测序结果？有一次我设计的引物特异性不高，PCR结果也显示片段偏小。出于好奇，我拿去测序，发现是自己的片段。

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静待潘多拉的旋律
5楼2018-08-30 18:42:52
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ylc6351

铁杆木虫 (文坛精英)
从来没有见过！

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6楼2018-08-30 18:52:49
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:17:27
如果之前构建是酶切连接方式构建，可以尝试无缝连接，有很多这类试剂盒，非常好用
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7楼2018-08-31 05:42:14
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兜转十年

禁虫 (初入文坛)
★
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9楼2018-08-31 14:42:17
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