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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建重组质粒屡次失败
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apple53

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
每一步具体说了才知道原因 不然那么多关键点

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21楼2018-09-06 21:57:06
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前行的璐

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我最近在构载体，得到的浓度20ng/ul,两管回收的，T4连接酶，试了两次也没有连上，
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22楼2018-09-07 10:03:27
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a13515517892

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请把你的载体测序验证一下MCS区看看，感觉你这个载体不太对，可能对了其中某一个酶
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23楼2018-09-07 14:00:08
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快乐是选择

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by macgray11 at 2018-09-05 08:45:46
无缝克隆的效率是要比连接反应高的，但是需要重新设计引物；如果没有无缝克隆酶的话，我建议先验证一下载体，确认载体没有问题，然后再酶切；同时加大片段和载体的酶切量，建议载体和片段都切至少1ug，我一般是用的 ...

连接的基因是PGM，一开始是酶切1ug，这样的话酶切不完全啊，后来就在不断的降低酶切的量，最后降到50ng，对照板上的单菌落是少了，但是实验板上还是没有验证出阳性菌

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24楼2018-09-08 11:12:57
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快乐是选择

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
23楼: Originally posted by a13515517892 at 2018-09-07 14:00:08
请把你的载体测序验证一下MCS区看看，感觉你这个载体不太对，可能对了其中某一个酶

那难道是载体出了问题？

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25楼2018-09-08 11:13:33
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guhe

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
通过你的描述，我认为有两种可能：1：这两种限制性内切酶用的时间太长了，将质粒切不完全，新购买两支限制性内切酶；2：引物两端的酶切位点是否加有保护碱基，只有加有保护碱基后酶才能识别出目的片段的酶切位点。
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26楼2018-09-11 11:30:43
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