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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建重组质粒屡次失败
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快乐是选择

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by 墨秦墨秦 at 2018-08-30 18:42:52
有没有测序结果？有一次我设计的引物特异性不高，PCR结果也显示片段偏小。出于好奇，我拿去测序，发现是自己的片段。

没有送去测试，酶切开的那个质粒比空质粒小，切开的两条带也与实际不符
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11楼2018-08-31 21:21:49
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快乐是选择

新虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by soarrow at 2018-08-31 05:42:14
如果之前构建是酶切连接方式构建，可以尝试无缝连接，有很多这类试剂盒，非常好用

想请教无缝连接和酶切的区别，那个更好？
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12楼2018-08-31 21:28:58
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快乐是选择

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-08-31 08:57:57
按照我的经验是，酶切后的质粒浓度一定要高，怎么提高回收浓度呢？那就是多酶切几管，合并回收，之后用65℃加热的灭菌水冲洗

我的酶切后的浓度确实不高，每次几乎不超过10ng/ul，酶切的量50ng，切多了怕切不干净。

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13楼2018-09-01 08:52:10
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快乐是选择

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by 白话八股 at 2018-08-30 12:09:51
详细步骤说一下，不行换个酶切位点或者改下实验方案

载体6000bp左右，目的片段1700bp左右，酶切EcoRI、BamHI，酶切量50ng，各切8管回收。往往酶切载体和目的片段浓度都不算高，不超过10ng/ul。T4连接5小时，有时12小时。转化TOP10中，LB+Em 37℃培养24小时，挑菌快速验证，质粒有的与空质粒大小一样，有的比空质粒小。经酶切验证，有一个质粒酶切出两条带，但大小与实际不符。

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14楼2018-09-01 08:53:20
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
★
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12楼: Originally posted by 快乐是选择 at 2018-08-31 21:28:58
想请教无缝连接和酶切的区别，那个更好？...

各有所长，酶切的便宜。
无缝连接的贵点，可以一次连接2-5个片段，就是需要设计overlap引物---不过这个有专用软件，相对也很简单。
我实验的效果，无缝连接的成功率非常高，基本一把就搞定，偶尔再来一把。
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15楼2018-09-01 14:34:17
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快乐是选择

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by macgray11 at 2018-08-30 11:09:35
把你的实验详细说明一下，可以帮你分析看看

大神，请求助

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16楼2018-09-04 23:45:40
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macgray11

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
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渊博震天: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-09-06 22:56:53
本帖内容被屏蔽
17楼2018-09-05 08:45:46
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zw破风

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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10楼: Originally posted by 快乐是选择 at 2018-08-31 21:16:09
载体6000bp左右，目的片段1700bp左右，酶切EcoRI、BamHI，酶切量50ng，各切8管回收。往往酶切载体和目的片段浓度都不算高，不超过10ng/ul。T4连接5小时，有时12小时。转化TOP10中，LB+Em 37℃培养24小时，挑菌快速 ...

可能酶切不完全吧
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18楼2018-09-05 09:36:24
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爱画画烟酒僧

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
渊博震天: 鼓励回帖交流 2018-09-06 22:57:29
两个内切酶的最适酶切温度不一样，你酶切的时候应该注意一下，一个酶一个酶单独酶切。
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19楼2018-09-06 11:34:44
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泡沫12

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
渊博震天: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-09-06 22:57:16
我酶切体系20ul，酶各加1ul，载体和片段的量达1000ng
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20楼2018-09-06 21:15:00
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