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快乐是选择

新虫 (初入文坛)

[交流] 构建重组质粒屡次失败 已有15人参与

构建重组质粒,经快速验证重组质粒比空质粒还要小,是什么情况,一直找不到原因,我就空质粒也进行了酶切,没有问题。
现在构建质粒四个月了,一直构建不出来,构建出来一个也是全凭运气!

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渊博震天

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Yeast Display

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按照我的经验是,酶切后的质粒浓度一定要高,怎么提高回收浓度呢?那就是多酶切几管,合并回收,之后用65℃加热的灭菌水冲洗
8楼2018-08-31 08:57:57
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快乐是选择

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by macgray11 at 2018-08-30 11:09:35
把你的实验详细说明一下,可以帮你分析看看

载体6000bp左右,目的片段1700bp左右,酶切EcoRI、BamHI,酶切量50ng,各切8管回收。往往酶切载体和目的片段浓度都不算高,不超过10ng/ul。T4连接5小时,有时12小时。转化TOP10中,LB+Em 37℃培养24小时,挑菌快速验证,质粒有的与空质粒大小一样,有的比空质粒小。经酶切验证,有一个质粒酶切出两条带,但大小与实际不符。
10楼2018-08-31 21:16:09
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

丢给我嘛。。。很快滴。。。
2楼2018-08-30 11:03:31
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macgray11

禁虫 (小有名气)


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3楼2018-08-30 11:09:35
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白话八股

金虫 (正式写手)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:16:58
详细步骤说一下,不行换个酶切位点或者改下实验方案

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最爱的那个人会出现在身边。
4楼2018-08-30 12:09:51
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墨秦墨秦

银虫 (小有名气)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:17:11
有没有测序结果?有一次我设计的引物特异性不高,PCR结果也显示片段偏小。出于好奇,我拿去测序,发现是自己的片段。

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静待潘多拉的旋律
5楼2018-08-30 18:42:52
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ylc6351

铁杆木虫 (文坛精英)

6楼2018-08-30 18:52:49
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:17:27
如果之前构建是酶切连接方式构建,可以尝试无缝连接,有很多这类试剂盒,非常好用
7楼2018-08-31 05:42:14
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兜转十年

禁虫 (初入文坛)


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9楼2018-08-31 14:42:17
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