应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 基因回补的验证
381/1返回列表
查看: 4523  |  回复: 37
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

yoyoyou

新虫 (小有名气)

[交流] 基因回补的验证

请教，做缺失突变株的基因回补有两个月了，回补株的验证总是出现问题，首先，说一下我用的验证方法：1、重组质粒用pET-28a，带有卡那霉素抗性，回补株用卡那平板进行筛选；2、利用目的基因引物进行菌液PCR，看能否扩增出目的条带；3、另外设计一组目的基因外侧的长片段引物，提取DNA后进行PCR，看是否出现长片段的条带。现在我的主要问题出现在第3个验证，长片段总是P不出来，请教各位，有没有相似经历，有的话怎么解决？或者有什么更好的验证方法可以建议一下？谢谢各位啦
回复此楼

» 猜你喜欢

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2018-07-04 16:41:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
★
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
验证思路正确。建议有两个：1. southern. 经典实验。2. 多设计几对外侧引物试试。换适合长PCR酶。长远20kb以上就很难了。
赞一下 回复此楼
29楼2018-07-04 18:52:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yoyoyou

新虫 (小有名气)
引用回帖:
29楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-07-04 18:52:19
验证思路正确。建议有两个：1. southern. 经典实验。2. 多设计几对外侧引物试试。换适合长PCR酶。长远20kb以上就很难了。

谢谢回复！外侧引物2300bp，使用宝生物的Ex Taq酶，但是还有一个问题，使用相同的模板DNA，长片段有时可以扩增出来，有时不能，这是什么原因呢？
赞一下 回复此楼
32楼2018-07-04 19:27:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yoyoyou

新虫 (小有名气)
引用回帖:
29楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-07-04 18:52:19
验证思路正确。建议有两个：1. southern. 经典实验。2. 多设计几对外侧引物试试。换适合长PCR酶。长远20kb以上就很难了。

再追问一句，我的缺失突变株是用了氯霉素基因替代目的基因，回补的话，利用目的基因引物可以扩增出目的条带，但是长片段却不可以，这是为什么呢
赞一下 回复此楼
33楼2018-07-04 19:39:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
33楼: Originally posted by yoyoyou at 2018-07-04 19:39:25
再追问一句，我的缺失突变株是用了氯霉素基因替代目的基因，回补的话，利用目的基因引物可以扩增出目的条带，但是长片段却不可以，这是为什么呢...

可能还有残留的质粒，不在基因组。
你知道你需要做出什么样的结果，你也知道办法。不要让问题调查本身成为你的研究项目，多尝试不同办法，小心求证吧
赞一下 回复此楼
34楼2018-07-05 22:24:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

渊博震天

版主 (职业作家)
长片段有多长？

发自小木虫Android客户端
回复此楼
35楼2018-07-06 08:31:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yoyoyou

新虫 (小有名气)
引用回帖:
35楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-07-06 08:31:49
长片段有多长？

2200bp，我的缺失突变株是利用了氯霉素基因取代了目的基因，现在的问题是，回补株利用目的基因引物可以扩增出来目的条带，但是长片段的话，扩增测序结果显示的是氯霉素基因，有没有可能我的目的基因插到了细菌基因组的其他地方？
赞一下 回复此楼
36楼2018-07-09 13:20:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

呆呆戴戴

新虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
长片段有多长 验证目的基因其中一段就可以吧

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
37楼2018-07-12 11:15:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yoyoyou

新虫 (小有名气)
引用回帖:
37楼: Originally posted by 呆呆戴戴 at 2018-07-12 11:15:18
长片段有多长 验证目的基因其中一段就可以吧

长片段2300bp，目的基因包含在内，目的基因700bp和1400bp，长片段是在目的基因两侧延伸了几百bp，老师说是为了验证目的基因是不是正确的回补到了原来的位置，我现在问题在于回补株中目的基因可以P出来，但是长片段P不出来，这样可以算回补成功么？
赞一下 回复此楼
38楼2018-07-13 16:03:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
ufzdpf2182楼
2018-07-04 16:57   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
大大293楼
2018-07-04 17:06   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
发自小木虫Android客户端
cnzl6114楼
2018-07-04 17:08   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
jabfyzu915楼
2018-07-04 17:14   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
mpuamky456楼
2018-07-04 17:16   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
顶
youngen7楼
2018-07-04 17:19   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
mmjkmb1548楼
2018-07-04 17:19   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
cameekd119楼
2018-07-04 17:27   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
ztvtrr9010楼
2018-07-04 17:27   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
eudzh05511楼
2018-07-04 17:28   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
117921559112楼
2018-07-04 17:31   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
发自小木虫Android客户端
khhxg9813楼
2018-07-04 17:42   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
xdxkjhr29114楼
2018-07-04 17:43   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
vpbgg04615楼
2018-07-04 17:43   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
cutpk6616楼
2018-07-04 17:50   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
tbdzma9717楼
2018-07-04 17:51   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
zymzeth94618楼
2018-07-04 17:53   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
hhjuvxp9219楼
2018-07-04 18:01   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
star_zhang20楼
2018-07-04 18:13   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
jejjgd0821楼
2018-07-04 18:14   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
dkkrge62022楼
2018-07-04 18:15   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
kdsrzu76423楼
2018-07-04 18:21   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
tqqng3124楼
2018-07-04 18:31   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
cdfkvy0425楼
2018-07-04 18:43   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
pdcse7226楼
2018-07-04 18:44   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
wadedf9827楼
2018-07-04 18:46   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
mrebykz95128楼
2018-07-04 18:52   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
rduqcg7330楼
2018-07-04 18:53   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
ppezvfb4131楼
2018-07-04 18:53   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
相关版块跳转 我要订阅楼主 yoyoyou 的主题更新
381/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭