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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 基因回补的验证
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yoyoyou

新虫 (小有名气)

[交流] 基因回补的验证

请教，做缺失突变株的基因回补有两个月了，回补株的验证总是出现问题，首先，说一下我用的验证方法：1、重组质粒用pET-28a，带有卡那霉素抗性，回补株用卡那平板进行筛选；2、利用目的基因引物进行菌液PCR，看能否扩增出目的条带；3、另外设计一组目的基因外侧的长片段引物，提取DNA后进行PCR，看是否出现长片段的条带。现在我的主要问题出现在第3个验证，长片段总是P不出来，请教各位，有没有相似经历，有的话怎么解决？或者有什么更好的验证方法可以建议一下？谢谢各位啦
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1楼2018-07-04 16:41:25
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yoyoyou

新虫 (小有名气)
引用回帖:
29楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-07-04 18:52:19
验证思路正确。建议有两个：1. southern. 经典实验。2. 多设计几对外侧引物试试。换适合长PCR酶。长远20kb以上就很难了。

谢谢回复！外侧引物2300bp，使用宝生物的Ex Taq酶，但是还有一个问题，使用相同的模板DNA，长片段有时可以扩增出来，有时不能，这是什么原因呢？
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32楼2018-07-04 19:27:58
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大大293楼
2018-07-04 17:06   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
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117921559112楼
2018-07-04 17:31   回复  
yoyoyou(金币+1): 谢谢参与
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