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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 基因回补的验证
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yoyoyou

新虫 (小有名气)

[交流] 基因回补的验证

请教，做缺失突变株的基因回补有两个月了，回补株的验证总是出现问题，首先，说一下我用的验证方法：1、重组质粒用pET-28a，带有卡那霉素抗性，回补株用卡那平板进行筛选；2、利用目的基因引物进行菌液PCR，看能否扩增出目的条带；3、另外设计一组目的基因外侧的长片段引物，提取DNA后进行PCR，看是否出现长片段的条带。现在我的主要问题出现在第3个验证，长片段总是P不出来，请教各位，有没有相似经历，有的话怎么解决？或者有什么更好的验证方法可以建议一下？谢谢各位啦
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1楼2018-07-04 16:41:25
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yoyoyou

新虫 (小有名气)
引用回帖:
29楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-07-04 18:52:19
验证思路正确。建议有两个：1. southern. 经典实验。2. 多设计几对外侧引物试试。换适合长PCR酶。长远20kb以上就很难了。

谢谢回复！外侧引物2300bp，使用宝生物的Ex Taq酶，但是还有一个问题，使用相同的模板DNA，长片段有时可以扩增出来，有时不能，这是什么原因呢？
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32楼2018-07-04 19:27:58
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yoyoyou

新虫 (小有名气)
引用回帖:
29楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-07-04 18:52:19
验证思路正确。建议有两个：1. southern. 经典实验。2. 多设计几对外侧引物试试。换适合长PCR酶。长远20kb以上就很难了。

再追问一句，我的缺失突变株是用了氯霉素基因替代目的基因，回补的话，利用目的基因引物可以扩增出目的条带，但是长片段却不可以，这是为什么呢
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33楼2018-07-04 19:39:25
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yoyoyou

新虫 (小有名气)
引用回帖:
35楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-07-06 08:31:49
长片段有多长？

2200bp，我的缺失突变株是利用了氯霉素基因取代了目的基因，现在的问题是，回补株利用目的基因引物可以扩增出来目的条带，但是长片段的话，扩增测序结果显示的是氯霉素基因，有没有可能我的目的基因插到了细菌基因组的其他地方？
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36楼2018-07-09 13:20:55
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yoyoyou

新虫 (小有名气)
引用回帖:
37楼: Originally posted by 呆呆戴戴 at 2018-07-12 11:15:18
长片段有多长 验证目的基因其中一段就可以吧

长片段2300bp，目的基因包含在内，目的基因700bp和1400bp，长片段是在目的基因两侧延伸了几百bp，老师说是为了验证目的基因是不是正确的回补到了原来的位置，我现在问题在于回补株中目的基因可以P出来，但是长片段P不出来，这样可以算回补成功么？
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38楼2018-07-13 16:03:07
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