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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 分子生物学、蛋白表达
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吐司布丁7

新虫 (初入文坛)

[求助] 分子生物学、蛋白表达 已有3人参与

求助各位大神，最近用BL21表达pET系列重组质粒，用溶菌酶破碎细菌，但是离心之后，SDS-PAGE电泳结果显示上清没有蛋白条带，沉淀里有，课题组的师兄师姐的又没有问题，这是什么情况啊？感谢各位的指点
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1楼 2018-01-12 17:09:34
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

匿名

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2楼2018-01-12 17:30:44
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一米吃苹果

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

猜测溶菌酶没有起到作用，菌体没破开，试试高压破碎或者超市破碎吧，祝你好运
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13楼2018-03-11 10:09:01
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-02-22 08:15:21
你反应的条件是啥，LB？还是M9？还是别的，温度，诱导条件（IPTG浓度，诱导时间）每个样本都可能不一样，要具体看，如果是30度培养诱导3小时，可以降低到16到18度，诱导24小时，还有IPTG浓度，从高到低0.6-0.1等，除了这些，培养基也有好些种，每种也不一样。此外，BL21之外还可以用其他的菌株（Rosetta 2），本身DH5a也可以试一试。如果不行，再换载体，pET15，21，28等等。总之，需要条件摸索
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3楼2018-01-12 18:10:05
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hyperwaters

铜虫 (初入文坛)
首先，单纯用溶菌酶来裂解，效果很差的，所以你先要确定cell pellets真的裂解了？相差显微镜或结晶紫染色看看裂解效果吧，如果裂解效果很差，你目的蛋白可溶不可溶还另议。另外，减少诱导剂浓度 温度 加增渗剂 葡萄糖都可能改善可溶性。再次，这些措施都不行的话，重新构建表达系统如融合标签gst,mbp，sumo 和分子伴侣 折叠酶促溶.

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7楼2018-01-13 10:37:44
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ksws0465326

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 吐司布丁7 at 2018-01-12 20:41:40
用的LB培养基，诱导条件是：0.1mM的IPTG,16℃，140rpm，14-16h，现在纠结的问题是，就算我的目的蛋白没有表达，那菌体本身的蛋白应该会有表达吧？拿沉淀来电泳验证了是包涵体表达，就是很不能理解，为什么上清没有 ...

非目的蛋白都在包涵体里那很有可能你溶菌酶没有效果产生的，溶菌酶没做过，所以没法给出建议，我一般都只用超声破碎
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9楼2018-01-15 13:01:05
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吴秋兰

新虫 (小有名气)
你好，我也是出现和你一样的情况，我们可以交流下

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12楼2018-02-27 18:16:14
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普通回帖

吐司布丁7

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 18840843935 at 2018-01-12 17:30:44
改变诱导条件试试，就是优化一下条件，诱导剂浓度低一点，温度低一点什么的，目的是慢慢的表达，然后好有时间折叠表达出可溶蛋白

诱导条件是：IPTG的终浓度0.1mM，16℃、120rpm,14-16h。
主要是上清几乎没有任何条带，这个跟蛋白表达的诱导条件关系大吗?就算我的目的蛋白没有表达，也应该有一些菌体自身的蛋白条带才对吧？
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4楼2018-01-12 20:35:27
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吐司布丁7

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ksws0465326 at 2018-01-12 18:10:05
你反应的条件是啥，LB？还是M9？还是别的，温度，诱导条件（IPTG浓度，诱导时间）每个样本都可能不一样，要具体看，如果是30度培养诱导3小时，可以降低到16到18度，诱导24小时，还有IPTG浓度，从高到低0.6-0.1等，除 ...

用的LB培养基，诱导条件是：0.1mM的IPTG,16℃，140rpm，14-16h，现在纠结的问题是，就算我的目的蛋白没有表达，那菌体本身的蛋白应该会有表达吧？拿沉淀来电泳验证了是包涵体表达，就是很不能理解，为什么上清没有条带，我加入的溶菌酶的量有点高，这个会不会有影响？
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5楼2018-01-12 20:41:40
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匿名

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6楼2018-01-12 21:53:00
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吐司布丁7

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by hyperwaters at 2018-01-13 10:37:44
首先，单纯用溶菌酶来裂解，效果很差的，所以你先要确定cell pellets真的裂解了？相差显微镜或结晶紫染色看看裂解效果吧，如果裂解效果很差，你目的蛋白可溶不可溶还另议。另外，减少诱导剂浓度 温度 加增渗剂 葡萄 ...

感谢大神，我最近在做验证，看看是菌的问题还是我自己的操作问题
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8楼2018-01-15 10:44:25
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仙女王

新虫 (初入文坛)
可能有包涵体吧

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10楼2018-01-16 15:46:55
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