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吐司布丁7

新虫 (初入文坛)

[求助] 分子生物学、蛋白表达 已有3人参与

求助各位大神,最近用BL21表达pET系列重组质粒,用溶菌酶破碎细菌,但是离心之后,SDS-PAGE电泳结果显示上清没有蛋白条带,沉淀里有,课题组的师兄师姐的又没有问题,这是什么情况啊?感谢各位的指点
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吐司布丁7

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by hyperwaters at 2018-01-13 10:37:44
首先,单纯用溶菌酶来裂解,效果很差的,所以你先要确定cell pellets真的裂解了?相差显微镜或结晶紫染色看看裂解效果吧,如果裂解效果很差,你目的蛋白可溶不可溶还另议。另外,减少诱导剂浓度 温度 加增渗剂 葡萄 ...

感谢大神,我最近在做验证,看看是菌的问题还是我自己的操作问题
8楼2018-01-15 10:44:25
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匿名

用户注销 (正式写手)

本帖仅楼主可见
2楼2018-01-12 17:30:44
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-02-22 08:15:21
你反应的条件是啥,LB?还是M9?还是别的,温度,诱导条件(IPTG浓度,诱导时间)每个样本都可能不一样,要具体看,如果是30度培养诱导3小时,可以降低到16到18度,诱导24小时,还有IPTG浓度,从高到低0.6-0.1等,除了这些,培养基也有好些种,每种也不一样。此外,BL21之外还可以用其他的菌株(Rosetta 2),本身DH5a也可以试一试。如果不行,再换载体,pET15,21,28等等。总之,需要条件摸索
3楼2018-01-12 18:10:05
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吐司布丁7

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 18840843935 at 2018-01-12 17:30:44
改变诱导条件试试,就是优化一下条件,诱导剂浓度低一点,温度低一点什么的,目的是慢慢的表达,然后好有时间折叠表达出可溶蛋白

诱导条件是:IPTG的终浓度0.1mM,16℃、120rpm,14-16h。
主要是上清几乎没有任何条带,这个跟蛋白表达的诱导条件关系大吗?就算我的目的蛋白没有表达,也应该有一些菌体自身的蛋白条带才对吧?
4楼2018-01-12 20:35:27
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