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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 免疫实验 » 酵母蛋白His标签不挂Ni柱
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renyanbin

铁虫 (初入文坛)

[求助] 酵母蛋白His标签不挂Ni柱

求教各位大咖：
近日一直在做一个酵母表达蛋白的纯化，pPINK载体，C端带His标签，怎么都不挂Ni-NTA柱子。体系用的20mM PBS+0.35M NaCl，洗脱加0.5M咪唑，pH7.4。纯化得率只有10%。求教各位大咖。
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1楼 2017-12-31 16:05:26
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
分泌表达蛋白都在培养基里吧？不知道你上柱子之前是怎么处理的。我之前做的时候也遇到过，后来分析原因是上柱前处理不彻底，培养基某些成分影响了挂柱，而且本来分泌表达，浓度就不高。后来浓缩后换液，好了一些，但得率仍然不高。

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5楼2018-01-01 09:19:58
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awaken2013

铜虫 (小有名气)
可能的因素很多 c端his6可能会包埋 建议尝试换n端标签

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4楼2018-01-01 02:19:10
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awaken2013

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by renyanbin at 2018-01-01 15:35:25
N端有信号肽，怕影响切割。...

瞎担心 我做了几十个蛋白都好好的

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8楼2018-01-01 16:56:17
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
分泌表达？

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2楼2017-12-31 16:57:01
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renyanbin

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mlbiosci at 2017-12-31 16:57:01
分泌表达？

恩 是的
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3楼2017-12-31 22:54:35
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renyanbin

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by mlbiosci at 2018-01-01 09:19:58
分泌表达蛋白都在培养基里吧？不知道你上柱子之前是怎么处理的。我之前做的时候也遇到过，后来分析原因是上柱前处理不彻底，培养基某些成分影响了挂柱，而且本来分泌表达，浓度就不高。后来浓缩后换液，好了一些，但 ...

调pH到7.4.过滤去除沉淀，这个时候测活性基本没有损失。然后用等比例的HisA稀释后，低速上样。挂柱delve只有10-20%
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6楼2018-01-01 15:34:16
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renyanbin

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by awaken2013 at 2018-01-01 02:19:10
可能的因素很多 c端his6可能会包埋 建议尝试换n端标签

N端有信号肽，怕影响切割。
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7楼2018-01-01 15:35:25
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renyanbin

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by awaken2013 at 2018-01-01 16:56:17
瞎担心 我做了几十个蛋白都好好的
...

准备试试
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9楼2018-01-01 17:01:39
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zyb6401

新虫 (初入文坛)
首先考虑目标样品密度，再有考虑标签是否完全暴露出来，还有样品前处理是否到位，如有还原剂或者螯合剂会影响吸附，还有就是Ni-NTA吸附载量较小，可用Ni-IDA试用，载量较大

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10楼2018-01-02 21:50:59
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