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renyanbin

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 酵母蛋白His标签不挂Ni柱

求教各位大咖：
近日一直在做一个酵母表达蛋白的纯化，pPINK载体，C端带His标签，怎么都不挂Ni-NTA柱子。体系用的20mM PBS+0.35M NaCl，洗脱加0.5M咪唑，pH7.4。纯化得率只有10%。求教各位大咖。

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1楼2017-12-31 16:05:26

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renyanbin

铁虫 (初入文坛)

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引用回帖:

5楼: Originally posted by mlbiosci at 2018-01-01 09:19:58
分泌表达蛋白都在培养基里吧？不知道你上柱子之前是怎么处理的。我之前做的时候也遇到过，后来分析原因是上柱前处理不彻底，培养基某些成分影响了挂柱，而且本来分泌表达，浓度就不高。后来浓缩后换液，好了一些，但 ...

调pH到7.4.过滤去除沉淀，这个时候测活性基本没有损失。然后用等比例的HisA稀释后，低速上样。挂柱delve只有10-20%