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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助】western 封闭液的原理和选择？
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轩辕十四II

[交流] 【求助】western 封闭液的原理和选择？

如上，越详细越好
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1楼 2009-02-17 22:14:16
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
轩辕十四II(金币+2,VIP+0):谢谢。再请教一下用什么方法什么来进行抗体鉴定呢？ 2-18 20:56
封闭就是降低一抗的非特异结合的概率
因为封闭液本身就是蛋白，封闭就相当于把那些太容易发生非特异结合的位点先给堵上了
一般用BSA或者脱脂牛奶
很多人的经验是：脱脂牛奶封闭后背景比较干净，而检测磷酸化蛋白则用BSA（因脱脂牛奶含有较多的磷酸化蛋白，会干扰的）
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2楼2009-02-17 23:14:18
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader
★ ★
轩辕十四II(金币+2,VIP+0):谢谢 2-18 21:38
blocking buffer 一般是用1*TBST（TBS+TWEEN20）+脱脂牛奶粉末（有的用PBS+BSA(终浓度10%)如楼上所说），配成终浓度是5%的乳液，主要作用就是把膜上的非特异性位点(疏水结合位点)block住了，这样防止在加primary antibody时产生的非特异性结合；通常blotting的时间是室温2个小时，或者4℃过夜，然后加入到primary antibody溶液（已经稀释1：50）中，进行抗原和抗体的结合。
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会当凌绝顶，一览众山小
3楼2009-02-18 01:00:56
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07shenhan

铁虫 (初入文坛)

十分有用 谢谢

刚接触生物实验，一直在找封闭液的用途，百度了都找不到，在这里可算找到了，谢谢啊！
如果能有更详细地介绍就更好了，呵呵！
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4楼2009-07-06 21:16:46
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zplipeng

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by sutao1979 at 2009-2-18 01:00:
blocking buffer 一般是用1*TBST（TBS+TWEEN20）+脱脂牛奶粉末（有的用PBS+BSA(终浓度10%)如楼上所说），配成终浓度是5%的乳液，主要作用就是把膜上的非特异性位点(疏水结合位点)block住了，这样防止在加primary  ...

非常详细，学习下
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加油哦↖(^ω^)↗，O(∩_∩)O哈哈~
5楼2009-07-06 21:23:12
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jiaminl

铁杆木虫 (知名作家)
路过顶一下
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Nevergiveup!
6楼2009-07-06 22:27:31
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nancy20052008

木虫 (正式写手)
在电泳转膜后，膜上其它没有结合蛋白质的空白位置需要用封闭液加以封闭，以避免非特异性结合。这是由于Western Blotting的灵敏度，特异性在很大程度取决于封闭的好坏。过度的封闭导致抗原表位的遮蔽，从而降低检测灵敏度。不完全封闭又会导致最终背景增高或信噪比太低。最常用的封闭液是脱脂奶粉，由于脱脂奶粉的成分比较复杂，里面微量的生物素或碱性磷酸酶就可能造成背景的污染，脱脂奶粉里的其它微量蛋白质有可能和待检测抗原有相似的抗体识别表位而造成交叉反应。
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7楼2009-07-07 19:18:20
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