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luck12345678新虫 (小有名气)
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连接超表达载体后，转化大肠杆菌总是没有阳性克隆怎么回事？ 已有1人参与
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大哥大姐们，我最近做了两次酶切连接转化大肠杆菌了，挑菌时总是没有阳性克隆，，，，酶切也切出来了，连接也出来了，可是就是转化后没有阳性克隆怎么回事，求帮助求指点。。。。。图分别是酶切后，连接后，跟转化后菌液pcr   @wizardfan @wizardfan 发自小木虫Android客户端 |
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挑几个菌落摇下菌，看一下长不？可能要多弄些，然后送测，测时叫公司设计引物从载体上开始测。 发自小木虫Android客户端 |
5楼2017-09-20 09:11:10
mlxmiao
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1.延长融合时间，我一般是40-60分钟。 2.体系可以减半，尽量不加水，多加线性化载体和你的东西。用分光光度计测下，按合适的比例，摩尔比3以上。最好都是胶回收的，这样比较纯。 3.重合碱基增多，20-25，引物估计要50bp了。 4.摇菌时可以多放点LB，时间加长，起码1.5h以上。 5.板子上20小时以后长的估计都是感受态了。密密麻麻的是因为时间长了抗生素失效了。 6.用一般连接酶做也可以，不过PCR酶、连接酶最好买好的。 发自小木虫Android客户端 |
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luck1234567810楼2017-09-23 20:55:48
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