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mlxmiao

木虫 (著名写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 涯天一方 at 2017-09-23 20:13:20
您好,我最近也是做过表达,普通连接,转化后第二天不长菌,第三天会长出密密麻麻的小菌,验证后不对。用融合的方法做了,还是出现同样的问题,这是什么问题呢...

融合的效率没有说明书讲的那么好,他们的东西都是非常纯的东西,而且线性载体也不长,和TA克隆的差不多。而我们实验的一般都近10K了,所以不好连。最后长的菌落不会很多。

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11楼2017-09-23 20:59:11
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涯天一方

新虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by mlxmiao at 2017-09-23 20:59:11
融合的效率没有说明书讲的那么好,他们的东西都是非常纯的东西,而且线性载体也不长,和TA克隆的差不多。而我们实验的一般都近10K了,所以不好连。最后长的菌落不会很多。
...

我这个是涂布过夜后第二天一点都不长,第三天会长出密密麻麻的菌,不知道是什么原因,很头疼
12楼2017-09-23 21:59:33
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涯天一方

新虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by mlxmiao at 2017-09-23 20:55:48
1.延长融合时间,我一般是40-60分钟。
2.体系可以减半,尽量不加水,多加线性化载体和你的东西。用分光光度计测下,按合适的比例,摩尔比3以上。最好都是胶回收的,这样比较纯。
3.重合碱基增多,20-25,引物估计要 ...

1,融合时间是按说明书来的,37℃,30min,说明书特别强调如果延长时间会降低连接效率,我也不敢调整
2,目的片段和载体都是通过胶回收的,而且目的片段是先连接到T载体后再切割下来的设计引物时都加入了酶切位点,融合方法的10微升体系中没有加水,摩尔比基本是按3:1, 1微升连接酶,2微升buffer,条件是37℃,30min;T4连接酶的10微升体系中也没有加水,摩尔比3:1,1微升连接酶,1微升buffer,条件是22℃3h或者4℃过夜
3,融合时重合碱基在20bp左右
4,转化后摇菌时加的是SOC培养基,时间再1h左右
5,融合用的连接酶做做其他实验时效率很高,做这个就不行了,普通的T4连接酶是promega的
如果说平板上长得是感受态,这说明根本没有连接成功啊,,这可怎么办,好像没有其他方法可以连接了吧。请问根据您的经验,应该从哪方面解决呢
13楼2017-09-23 22:20:06
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mlxmiao

木虫 (著名写手)

引用回帖:
13楼: Originally posted by 涯天一方 at 2017-09-23 22:20:06
1,融合时间是按说明书来的,37℃,30min,说明书特别强调如果延长时间会降低连接效率,我也不敢调整
2,目的片段和载体都是通过胶回收的,而且目的片段是先连接到T载体后再切割下来的设计引物时都加入了酶切位点 ...

是感受大肠或农杆等菌
没有法子,多做几回吧。回收时少加水,尽量让浓度高点,这样加的东西就多了。另外,可以扩大体系(就做几个的话),然后分几管摇吧。

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14楼2017-09-23 22:46:26
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luck12345678

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by mlxmiao at 2017-09-23 20:55:48
1.延长融合时间,我一般是40-60分钟。
2.体系可以减半,尽量不加水,多加线性化载体和你的东西。用分光光度计测下,按合适的比例,摩尔比3以上。最好都是胶回收的,这样比较纯。
3.重合碱基增多,20-25,引物估计要 ...

谢谢谢谢,,太感谢了,,谢谢

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15楼2017-10-07 12:51:35
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luck12345678

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by mlxmiao at 2017-09-23 22:46:26
是感受大肠或农杆等菌
没有法子,多做几回吧。回收时少加水,尽量让浓度高点,这样加的东西就多了。另外,可以扩大体系(就做几个的话),然后分几管摇吧。
...

谢谢谢谢

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16楼2017-10-07 12:51:53
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你好青橄榄

新虫 (初入文坛)

你用的超表达载体是什么载体

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17楼2017-10-27 00:18:44
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