9楼: Originally posted by 涯天一方 at 2017-09-23 20:13:20
您好，我最近也是做过表达，普通连接，转化后第二天不长菌，第三天会长出密密麻麻的小菌，验证后不对。用融合的方法做了，还是出现同样的问题，这是什么问题呢...

11楼: Originally posted by mlxmiao at 2017-09-23 20:59:11
融合的效率没有说明书讲的那么好，他们的东西都是非常纯的东西，而且线性载体也不长，和TA克隆的差不多。而我们实验的一般都近10K了，所以不好连。最后长的菌落不会很多。
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10楼: Originally posted by mlxmiao at 2017-09-23 20:55:48
1.延长融合时间，我一般是40-60分钟。
2.体系可以减半，尽量不加水，多加线性化载体和你的东西。用分光光度计测下，按合适的比例，摩尔比3以上。最好都是胶回收的，这样比较纯。
3.重合碱基增多，20-25，引物估计要 ...

13楼: Originally posted by 涯天一方 at 2017-09-23 22:20:06
1，融合时间是按说明书来的，37℃，30min，说明书特别强调如果延长时间会降低连接效率，我也不敢调整
2，目的片段和载体都是通过胶回收的，而且目的片段是先连接到T载体后再切割下来的设计引物时都加入了酶切位点 ...

10楼: Originally posted by mlxmiao at 2017-09-23 20:55:48
1.延长融合时间，我一般是40-60分钟。
2.体系可以减半，尽量不加水，多加线性化载体和你的东西。用分光光度计测下，按合适的比例，摩尔比3以上。最好都是胶回收的，这样比较纯。
3.重合碱基增多，20-25，引物估计要 ...

14楼: Originally posted by mlxmiao at 2017-09-23 22:46:26
是感受大肠或农杆等菌
没有法子，多做几回吧。回收时少加水，尽量让浓度高点，这样加的东西就多了。另外，可以扩大体系（就做几个的话），然后分几管摇吧。
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