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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接超表达载体后，转化大肠杆菌总是没有阳性克隆怎么回事？
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luck12345678

新虫 (小有名气)

[求助] 连接超表达载体后，转化大肠杆菌总是没有阳性克隆怎么回事？ 已有1人参与

大哥大姐们，我最近做了两次酶切连接转化大肠杆菌了，挑菌时总是没有阳性克隆，，，，酶切也切出来了，连接也出来了，可是就是转化后没有阳性克隆怎么回事，求帮助求指点。。。。。图分别是酶切后，连接后，跟转化后菌液pcr

连接超表达载体后，转化大肠杆菌总是没有阳性克隆怎么回事？


连接超表达载体后，转化大肠杆菌总是没有阳性克隆怎么回事？-1


连接超表达载体后，转化大肠杆菌总是没有阳性克隆怎么回事？-2


@wizardfan @wizardfan 发自小木虫Android客户端
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1楼 2017-09-20 08:32:59
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mlxmiao

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-23 20:39:37
挑几个菌落摇下菌，看一下长不？可能要多弄些，然后送测，测时叫公司设计引物从载体上开始测。

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5楼2017-09-20 09:11:10
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mlxmiao

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by luck12345678 at 2017-09-20 12:40:15
谢谢解答，我这是连t载体的时候测过的，没有问题的，，，这个是从t载体切下来后与超表达载体连接，转化总是转不上
...

那就是没有连上。载体片段与目的片段加大浓度和时间。还不行，换个方法，如融合

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7楼2017-09-20 14:19:34
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mlxmiao

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-10-27 07:45:20
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9楼: Originally posted by 涯天一方 at 2017-09-23 20:13:20
您好，我最近也是做过表达，普通连接，转化后第二天不长菌，第三天会长出密密麻麻的小菌，验证后不对。用融合的方法做了，还是出现同样的问题，这是什么问题呢...

1.延长融合时间，我一般是40-60分钟。
2.体系可以减半，尽量不加水，多加线性化载体和你的东西。用分光光度计测下，按合适的比例，摩尔比3以上。最好都是胶回收的，这样比较纯。
3.重合碱基增多，20-25，引物估计要50bp了。
4.摇菌时可以多放点LB，时间加长，起码1.5h以上。
5.板子上20小时以后长的估计都是感受态了。密密麻麻的是因为时间长了抗生素失效了。
6.用一般连接酶做也可以，不过PCR酶、连接酶最好买好的。

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luck12345678
10楼2017-09-23 20:55:48
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普通回帖

luck12345678

新虫 (小有名气)


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2楼2017-09-20 08:37:01
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luck12345678

新虫 (小有名气)
连接超表达载体后，转化大肠杆菌总是没有阳性克隆怎么回事？-3

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3楼2017-09-20 08:37:39
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luck12345678

新虫 (小有名气)
专家怎么邀请呢

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4楼2017-09-20 08:37:58
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luck12345678

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by mlxmiao at 2017-09-20 09:11:10
挑几个菌落摇下菌，看一下长不？可能要多弄些，然后送测，测时叫公司设计引物从载体上开始测。

谢谢解答，我这是连t载体的时候测过的，没有问题的，，，这个是从t载体切下来后与超表达载体连接，转化总是转不上

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6楼2017-09-20 12:40:15
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luck12345678

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by mlxmiao at 2017-09-20 14:19:34
那就是没有连上。载体片段与目的片段加大浓度和时间。还不行，换个方法，如融合
...

谢谢谢谢，回去再看看融合这个法

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8楼2017-09-20 14:31:06
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涯天一方

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by mlxmiao at 2017-09-20 14:19:34
那就是没有连上。载体片段与目的片段加大浓度和时间。还不行，换个方法，如融合
...

您好，我最近也是做过表达，普通连接，转化后第二天不长菌，第三天会长出密密麻麻的小菌，验证后不对。用融合的方法做了，还是出现同样的问题，这是什么问题呢
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9楼2017-09-23 20:13:20
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