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片段连了半年了，死活连不上，要看再不行就要延期了，求大神帮忙分析一下 已有3人参与
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首先我一共要连接三个片段，直接连接表达载体，这三个片段都属于同一个基因家族，就是同源性不高，片段是pcr得到的（提取的研究材料全RNA反转录得到的cDNA），采用双酶切的方法，选取的是sal1和BamH1两个酶切位点，这两个酶切位点在载体上离得很近，序列是（GTCGAC）TCTAGA（GGATTC），只间隔了6bp，不过我通过先用sal1酶切在用BamH1酶切的方法已经连接上了两个片段，这能说明我的载体酶切肯定是没问题的吧？而且三个片段都是同一操作流程，也就是说我设计的引物也没问题吧？片段酶切也没问题吧？但是，第三个片段，也是最关键的片段，就是死活连不上去，连上那两个片段其实就用了三个星期……本来我想着，因为原来的载体酶切后不好判断酶切程度，我可以通过酶切已经连上目的片段的重组质粒，跑胶回收酶切好的载体来做连接，但是，重组质粒，一切就碎，就跟pcr的引物二聚体似的，根本没法回收，重新提了一批原始质粒和片段做酶切，用50的体系，酶各加2，酶切4小时，跑胶发现，竟然也被切碎了，然后，减小酶量，各加1，发现还是碎了，是因为这次用的大体系酶切么？我之前酶切用的25的体系……求各位大神帮忙分析一下，描述比较混乱，我现在特别绝望…… @飞约疯人院 @biostar2009 发自小木虫IOS客户端 |
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 质粒表达 |
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23楼2017-09-18 07:53:43
31楼2017-09-19 22:29:42
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-17 12:42:22
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既然总是会切碎，就不要用酶切的方法喽。换换overlap的方法，推荐用一下天根的EasyGeno，便宜好用，我们现在都用这个。NEB的也用过，太贵了。 发自小木虫Android客户端 |
5楼2017-09-17 09:46:47
6楼2017-09-17 17:23:27
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10楼2017-09-17 18:39:44
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按道理酶切位点单一的话，特异性应该很好。你用的那个公司的酶，换个牌子试试，或者换个快切的酶，另外酶切时间不要太长，酶切完记得终止反应，防止乱切。 发自小木虫Android客户端 |
21楼2017-09-17 23:37:34
ken19860823
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29楼2017-09-19 16:48:43
30楼2017-09-19 16:50:21
32楼2017-09-19 22:31:59
【答案】应助回帖
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拙见如下： 1. 千万不要把你确定连上的重组载体作为第三个片段的载体，除非你能确定用重组载体做载体时能够酶切完全。 2. T载体买着不贵，或者你可以借，其实也可以自己做，方法网上有。你把PCR产物连到T载上，转化的大肠杆菌保存，需要扩增的时候也不需要PCR了，摇菌过夜提质粒就行，而且这个酶切结果更可靠。 3. 你的PCR引物是怎样设计的？两端是酶切位点吗？那有没有设计保护碱基呢？这会影响你的酶切效果。 4. 你是如何确定自己的重组质粒构建成功的？酶切、PCR、测序都没有问题吗？测序引物用的什么？ 5. 你的载体和重组质粒保存了多久？什么条件？冻融次数多吗？会不会已经降解了？ |
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