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不吃M的鱼

金虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 不吃M的鱼 at 2017-09-17 18:39:44
你连3个片段怎么只用了2个片段?是一个一个连上去的吗?我们通常是4个酶切位点,切好了一块连的。

看错了,你是要把3个片段分别连到同一个载体上,那你载体直接用前面酶切的不是很好吗?你是之前连的空载太多了吗?

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11楼2017-09-17 18:42:22
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感觉要延期哎

新虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 不吃M的鱼 at 2017-09-17 18:42:22
看错了,你是要把3个片段分别连到同一个载体上,那你载体直接用前面酶切的不是很好吗?你是之前连的空载太多了吗?
...

不不不,是分别连,不好意思我没说清楚,我是要构建三个重组载体

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12楼2017-09-17 18:56:57
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不吃M的鱼

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 感觉要延期哎 at 2017-09-16 23:21:54
最不能理解的是我的目的片段也被切碎了,这是为什么呢,直接过柱回收根本没东西,第三,四道是回收片段图

...

第三第四道是你PCR产物的图?我建议你测个序看看有没有突变,还有就是酶切的片段量是不是太少了,通常要都切上的。不然量不够

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13楼2017-09-17 19:54:06
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感觉要延期哎

新虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 不吃M的鱼 at 2017-09-17 18:39:44
你连3个片段怎么只用了2个片段?是一个一个连上去的吗?我们通常是4个酶切位点,切好了一块连的。

我是三个片段分别连到载体上,构建三个重组载体……我这个描述的时候表达可能有问题

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14楼2017-09-17 19:58:14
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感觉要延期哎

新虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by 不吃M的鱼 at 2017-09-17 19:54:06
第三第四道是你PCR产物的图?我建议你测个序看看有没有突变,还有就是酶切的片段量是不是太少了,通常要都切上的。不然量不够
...

我酶切的这个重组载体是测过序的,我也分析了测序结果,还是不存在我选择的这两个酶切位点的,但是因为测序两端的准确性不高,所以我也不好判断它是不是突变了,不过刚连上的时候我做酶切鉴定,一个小时酶切,是没有问题的,这是当时的酶切鉴定图
片段连了半年了,死活连不上,要看再不行就要延期了,求大神帮忙分析一下



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15楼2017-09-17 20:03:50
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黑胡椒牛排

新虫 (初入文坛)

连进去的两个有没有去测序验证过

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16楼2017-09-17 22:02:43
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ken19860823

木虫 (正式写手)

你先别纠结你那个中间载体了,你酶切原始载体先连第三个片段。如果没问题再连另外两个片段。先试试,有些片段克隆有方向性的。如果是这个问题,换个载体重新克隆或者换个感受态试试。半年早该各种都试过了,现在来这里不知道有用没啊。

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做基因修饰的老菜鸡
17楼2017-09-17 22:37:00
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感觉要延期哎

新虫 (小有名气)

我是三个片段要单独连接载体,构建三个重组载体,我初始的描述可能不太对……

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18楼2017-09-17 22:54:26
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感觉要延期哎

新虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 黑胡椒牛排 at 2017-09-17 22:02:43
连进去的两个有没有去测序验证过

我是分别用三个片段构建三个重组载体,连上的两个已经送测序了

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19楼2017-09-17 22:55:35
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感觉要延期哎

新虫 (小有名气)

引用回帖:
17楼: Originally posted by ken19860823 at 2017-09-17 22:37:00
你先别纠结你那个中间载体了,你酶切原始载体先连第三个片段。如果没问题再连另外两个片段。先试试,有些片段克隆有方向性的。如果是这个问题,换个载体重新克隆或者换个感受态试试。半年早该各种都试过了,现在来这 ...

我表述有误,我是要用三个片段构建三个重组载体,不是都连进一个载体里边

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20楼2017-09-17 22:56:52
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