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NEVER000

木虫 (小有名气)

为啥不采用Gibson assembly方法呢?一步搞定,哪有那么麻烦

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31楼2017-09-19 22:29:42
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hzau103

新虫 (正式写手)

为什么不试试一步克隆试剂盒,推荐用诺唯赞的,可以试试。

发自小木虫Android客户端
32楼2017-09-19 22:31:59
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huhao0230

金虫 (初入文坛)

1.切碎那你就换回原来的体系酶切,有些问题确实解释不通。
2.连接不行,建议换方法。现在我们实验室做克隆都是使用同源重组的方法,阳性率很高。推荐诺唯赞的同源重组酶!!!他家其余的东西啧啧啧。。。
33楼2017-09-22 15:26:18
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感觉要延期哎

新虫 (小有名气)

引用回帖:
33楼: Originally posted by huhao0230 at 2017-09-22 15:26:18
1.切碎那你就换回原来的体系酶切,有些问题确实解释不通。
2.连接不行,建议换方法。现在我们实验室做克隆都是使用同源重组的方法,阳性率很高。推荐诺唯赞的同源重组酶!!!他家其余的东西啧啧啧。。。

我能说,我一开始用的就是重组酶么……就是连不上,我才换了双酶切

发自小木虫IOS客户端
34楼2017-09-25 22:23:31
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

不好连的话,可以试试无缝克隆。你描述的那俩酶切位点确实离的太近。

发自小木虫Android客户端
35楼2017-09-25 22:45:43
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菜头Q

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

拙见如下:
1. 千万不要把你确定连上的重组载体作为第三个片段的载体,除非你能确定用重组载体做载体时能够酶切完全。
2. T载体买着不贵,或者你可以借,其实也可以自己做,方法网上有。你把PCR产物连到T载上,转化的大肠杆菌保存,需要扩增的时候也不需要PCR了,摇菌过夜提质粒就行,而且这个酶切结果更可靠。
3. 你的PCR引物是怎样设计的?两端是酶切位点吗?那有没有设计保护碱基呢?这会影响你的酶切效果。
4. 你是如何确定自己的重组质粒构建成功的?酶切、PCR、测序都没有问题吗?测序引物用的什么?
5. 你的载体和重组质粒保存了多久?什么条件?冻融次数多吗?会不会已经降解了?
36楼2017-10-31 17:10:26
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wyplr

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 感觉要延期哎 at 2017-09-16 23:21:54
最不能理解的是我的目的片段也被切碎了,这是为什么呢,直接过柱回收根本没东西,第三,四道是回收片段图

...

不能用前面连上的两个载体所用的那一批酶切载体连吗?如果连不上,很大原因应该就是载体,酶和PCR产物的配比了,PCR浓度不能太高,太高了很容易出现连不上的情况,你的都是小片段,是非常好连的。
37楼2017-11-01 20:10:51
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