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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 片段连了半年了，死活连不上，要看再不行就要延期了，求大神帮忙分析一下
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NEVER000

木虫 (小有名气)
为啥不采用Gibson assembly方法呢？一步搞定，哪有那么麻烦

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31楼2017-09-19 22:29:42
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hzau103

新虫 (正式写手)
为什么不试试一步克隆试剂盒，推荐用诺唯赞的，可以试试。

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32楼2017-09-19 22:31:59
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huhao0230

金虫 (初入文坛)
1.切碎那你就换回原来的体系酶切，有些问题确实解释不通。
2.连接不行，建议换方法。现在我们实验室做克隆都是使用同源重组的方法，阳性率很高。推荐诺唯赞的同源重组酶！！！他家其余的东西啧啧啧。。。
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33楼2017-09-22 15:26:18
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感觉要延期哎

新虫 (小有名气)
引用回帖:
33楼: Originally posted by huhao0230 at 2017-09-22 15:26:18
1.切碎那你就换回原来的体系酶切，有些问题确实解释不通。
2.连接不行，建议换方法。现在我们实验室做克隆都是使用同源重组的方法，阳性率很高。推荐诺唯赞的同源重组酶！！！他家其余的东西啧啧啧。。。

我能说，我一开始用的就是重组酶么……就是连不上，我才换了双酶切

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34楼2017-09-25 22:23:31
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

不好连的话，可以试试无缝克隆。你描述的那俩酶切位点确实离的太近。

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35楼2017-09-25 22:45:43
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菜头Q

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

拙见如下：
1. 千万不要把你确定连上的重组载体作为第三个片段的载体，除非你能确定用重组载体做载体时能够酶切完全。
2. T载体买着不贵，或者你可以借，其实也可以自己做，方法网上有。你把PCR产物连到T载上，转化的大肠杆菌保存，需要扩增的时候也不需要PCR了，摇菌过夜提质粒就行，而且这个酶切结果更可靠。
3. 你的PCR引物是怎样设计的？两端是酶切位点吗？那有没有设计保护碱基呢？这会影响你的酶切效果。
4. 你是如何确定自己的重组质粒构建成功的？酶切、PCR、测序都没有问题吗？测序引物用的什么？
5. 你的载体和重组质粒保存了多久？什么条件？冻融次数多吗？会不会已经降解了？
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36楼2017-10-31 17:10:26
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wyplr

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 感觉要延期哎 at 2017-09-16 23:21:54
最不能理解的是我的目的片段也被切碎了，这是为什么呢，直接过柱回收根本没东西，第三，四道是回收片段图

...

不能用前面连上的两个载体所用的那一批酶切载体连吗？如果连不上，很大原因应该就是载体，酶和PCR产物的配比了，PCR浓度不能太高，太高了很容易出现连不上的情况，你的都是小片段，是非常好连的。
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37楼2017-11-01 20:10:51
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