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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 片段连了半年了，死活连不上，要看再不行就要延期了，求大神帮忙分析一下
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HZAUAS

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 感觉要延期哎 at 2017-09-17 18:13:36
我查过说是载体大切效果不好，会是这个原因么
...

按道理酶切位点单一的话，特异性应该很好。你用的那个公司的酶，换个牌子试试，或者换个快切的酶，另外酶切时间不要太长，酶切完记得终止反应，防止乱切。

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21楼2017-09-17 23:37:34
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感觉要延期哎

新虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by HZAUAS at 2017-09-17 23:37:34
按道理酶切位点单一的话，特异性应该很好。你用的那个公司的酶，换个牌子试试，或者换个快切的酶，另外酶切时间不要太长，酶切完记得终止反应，防止乱切。
...

好的，我尝试做一个酶量和酶切时间的梯度试试看

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22楼2017-09-17 23:39:15
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黑胡椒牛排

新虫 (初入文坛)
都测序过了，应该是没问题的啊……酶切时间是有点长，一般半个小时就够了……    搞不定就找公司做啊……PCR克隆也就几百块，何必纠结大半年

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23楼2017-09-18 07:53:43
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ken19860823

木虫 (正式写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by 感觉要延期哎 at 2017-09-17 22:56:52
我表述有误，我是要用三个片段构建三个重组载体，不是都连进一个载体里边
...

那就先ta克隆下看看，看能不能克隆。如果双向都有，就酶切下来连到你的目的载体。

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做基因修饰的老菜鸡
24楼2017-09-18 08:24:15
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感觉要延期哎

新虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by ken19860823 at 2017-09-18 08:24:15
那就先ta克隆下看看，看能不能克隆。如果双向都有，就酶切下来连到你的目的载体。
...

实验室就我用的这一个表达载体，没有t载体……比较穷困

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25楼2017-09-18 08:25:17
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ken19860823

木虫 (正式写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 感觉要延期哎 at 2017-09-18 08:25:17
实验室就我用的这一个表达载体，没有t载体……比较穷困
...

有的片段表(v在V型他嘎鱼v额v啊vv有vvv找他拆塔下雨擦擦真嘎擦擦出发vv啊GV要 TV去啊vv刚才雨真嘎GGAV让送vv的v在达会对不好用细菌有毒性的，换穿梭载体或者感受态是克隆实验你背的。

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做基因修饰的老菜鸡
26楼2017-09-18 08:30:17
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ken19860823

木虫 (正式写手)
送红花一朵


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27楼2017-09-18 08:30:27
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ken19860823

木虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by ken19860823 at 2017-09-18 08:30:17
有的片段表(v在V型他嘎鱼v额v啊vv有vvv找他拆塔下雨擦擦真嘎擦擦出发vv啊GV要 TV去啊vv刚才雨真嘎GGAV让送vv的v在达会对不好用细菌有毒性的，换穿梭载体或者感受态是克隆实验你背的。
...

如果目的片段不能在该菌株扩增，这实验怎么设计都没用。另外你已经构建好的载体不能酶切获得模板这个问题，送测序，质粒没问题就换酶。(刚才下公交车手机放兜里乱发了一条，请删除)

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做基因修饰的老菜鸡
28楼2017-09-18 08:37:19
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匿名

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29楼2017-09-19 16:48:43
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匿名

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30楼2017-09-19 16:50:21
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