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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 片段连了半年了，死活连不上，要看再不行就要延期了，求大神帮忙分析一下
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感觉要延期哎

新虫 (小有名气)

[求助] 片段连了半年了，死活连不上，要看再不行就要延期了，求大神帮忙分析一下 已有3人参与

首先我一共要连接三个片段，直接连接表达载体，这三个片段都属于同一个基因家族，就是同源性不高，片段是pcr得到的（提取的研究材料全RNA反转录得到的cDNA），采用双酶切的方法，选取的是sal1和BamH1两个酶切位点，这两个酶切位点在载体上离得很近，序列是（GTCGAC）TCTAGA（GGATTC），只间隔了6bp，不过我通过先用sal1酶切在用BamH1酶切的方法已经连接上了两个片段，这能说明我的载体酶切肯定是没问题的吧？而且三个片段都是同一操作流程，也就是说我设计的引物也没问题吧？片段酶切也没问题吧？但是，第三个片段，也是最关键的片段，就是死活连不上去，连上那两个片段其实就用了三个星期……本来我想着，因为原来的载体酶切后不好判断酶切程度，我可以通过酶切已经连上目的片段的重组质粒，跑胶回收酶切好的载体来做连接，但是，重组质粒，一切就碎，就跟pcr的引物二聚体似的，根本没法回收，重新提了一批原始质粒和片段做酶切，用50的体系，酶各加2，酶切4小时，跑胶发现，竟然也被切碎了，然后，减小酶量，各加1，发现还是碎了，是因为这次用的大体系酶切么？我之前酶切用的25的体系……求各位大神帮忙分析一下，描述比较混乱，我现在特别绝望……

@飞约疯人院 @biostar2009 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2017-09-16 23:18:49
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感觉要延期哎

新虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 感觉要延期哎 at 2017-09-16 23:18:49
首先我一共要连接三个片段，直接连接表达载体，这三个片段都属于同一个基因家族，就是同源性不高，片段是pcr得到的（提取的研究材料全RNA反转录得到的cDNA），采用双酶切的方法，选取的是sal1和BamH1两个酶切位点， ...

最不能理解的是我的目的片段也被切碎了，这是为什么呢，直接过柱回收根本没东西，第三，四道是回收片段图
片段连了半年了，死活连不上，要看再不行就要延期了，求大神帮忙分析一下



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3楼2017-09-16 23:21:54
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感觉要延期哎

新虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 感觉要延期哎 at 2017-09-16 23:18:49
首先我一共要连接三个片段，直接连接表达载体，这三个片段都属于同一个基因家族，就是同源性不高，片段是pcr得到的（提取的研究材料全RNA反转录得到的cDNA），采用双酶切的方法，选取的是sal1和BamH1两个酶切位点， ...

质粒酶切图
片段连了半年了，死活连不上，要看再不行就要延期了，求大神帮忙分析一下-1



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2楼2017-09-16 23:20:29
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感觉要延期哎

新虫 (小有名气)
求帮忙分析一下

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4楼2017-09-17 09:42:54
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不吃M的鱼

金虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-17 12:42:22
既然总是会切碎，就不要用酶切的方法喽。换换overlap的方法，推荐用一下天根的EasyGeno，便宜好用，我们现在都用这个。NEB的也用过，太贵了。

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5楼2017-09-17 09:46:47
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