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定点突变，电泳总是没有产物
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新手刚开始做定点突变，要做两个突变体，每个突变体包含两个点突变。由于突变点靠的近，设计的引物同时包含了两个突变位点，两对互补的引物长度分别为35，46bp，Tm在75度左右。 刚开始用prime star怎么都p不出来，后来换了KOD HOT START，用35bp的引物做了个剃度pcr，63-72度，结果63°有较量亮的条带，71°也有一天很暗的条带。后来扩大体系，同时用46bp的引物进行剃度pcr，60-75°，为了对比，我加了一个原始的重组质粒做对比，结果梯度pcr没有条带，35bp引物进行的突变倒是有条带，但和原始质粒位置不一致，跑得快了一些。 问老师，他让我按说明书来，同时退火温度用68°，因为他以前也用这个酶做过定点突变，就用的68°，结果都没有p出来。 很难受，这个KOD酶还比较贵，再这样下去都快被我造光了。 Pcr条件：95° 2min，95° 20s，68° 10s，70° 4min 发自小木虫IOS客户端 |
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我觉得是不是你引物设计的有问题啊？是2条引物分别是35，46吗？中间还有突变点，那你这个引物应该是短了吧？不管怎么说3端你都要有10来个碱基配对才好P。还有可以推荐用天根的一个突变试剂盒，还可以用PS酶P，只用他们那个酶消化。我一直在用，挺好用的。感兴趣可以问我。 发自小木虫Android客户端 |
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梦圆20162楼
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北极冬天3楼
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wulei14717楼
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xhmaohan20楼
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WinTey92922楼
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pandongzi24楼
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wyq17625楼
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