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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 定点突变，电泳总是没有产物
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18021900757

新虫 (小有名气)

[交流] 定点突变，电泳总是没有产物

新手刚开始做定点突变，要做两个突变体，每个突变体包含两个点突变。由于突变点靠的近，设计的引物同时包含了两个突变位点，两对互补的引物长度分别为35，46bp，Tm在75度左右。
刚开始用prime star怎么都p不出来，后来换了KOD HOT START，用35bp的引物做了个剃度pcr，63-72度，结果63°有较量亮的条带，71°也有一天很暗的条带。后来扩大体系，同时用46bp的引物进行剃度pcr，60-75°，为了对比，我加了一个原始的重组质粒做对比，结果梯度pcr没有条带，35bp引物进行的突变倒是有条带，但和原始质粒位置不一致，跑得快了一些。
问老师，他让我按说明书来，同时退火温度用68°，因为他以前也用这个酶做过定点突变，就用的68°，结果都没有p出来。
很难受，这个KOD酶还比较贵，再这样下去都快被我造光了。
Pcr条件：95° 2min，95° 20s，68° 10s，70° 4min

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北极冬天

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1楼 2017-09-04 23:53:36
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北极冬天

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
哎呦，不好意思，看着金币就领了，专业问题给不了建议。

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8楼2017-09-04 23:55:16
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北极冬天

新虫 (正式写手)
送红花一朵
送回去吧，哈哈

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9楼2017-09-04 23:55:59
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qqqqqq123456

至尊木虫 (职业作家)
温度高了？

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10楼2017-09-04 23:58:39
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轩辕佑德

至尊木虫 (职业作家)
★
18021900757(金币+1): 谢谢参与
帮顶

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13楼2017-09-05 00:26:06
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梦圆20162楼
2017-09-04 23:53   回复  
18021900757(金币+4): 谢谢参与
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北极冬天3楼
2017-09-04 23:54   回复  
18021900757(金币+3): 谢谢参与
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sxd5832969324楼
2017-09-04 23:54   回复  
18021900757(金币+3): 谢谢参与
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qqqqqq1234565楼
2017-09-04 23:54   回复  
18021900757(金币+4): 谢谢参与
已获得4个金币 发自小木虫Android客户端
努力一下下6楼
2017-09-04 23:54   回复  
18021900757(金币+2): 谢谢参与
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21_gram7楼
2017-09-04 23:55   回复  
18021900757(金币+5): 谢谢参与
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1802190075711楼
2017-09-04 23:59   回复  
star1991112812楼
2017-09-05 00:25   回复  
18021900757(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫IOS客户端
plantabiotic14楼
2017-09-05 00:30   回复  
18021900757(金币+1): 谢谢参与
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