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新虫 (小有名气)

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[交流] 定点突变，电泳总是没有产物

新手刚开始做定点突变，要做两个突变体，每个突变体包含两个点突变。由于突变点靠的近，设计的引物同时包含了两个突变位点，两对互补的引物长度分别为35，46bp，Tm在75度左右。
刚开始用prime star怎么都p不出来，后来换了KOD HOT START，用35bp的引物做了个剃度pcr，63-72度，结果63°有较量亮的条带，71°也有一天很暗的条带。后来扩大体系，同时用46bp的引物进行剃度pcr，60-75°，为了对比，我加了一个原始的重组质粒做对比，结果梯度pcr没有条带，35bp引物进行的突变倒是有条带，但和原始质粒位置不一致，跑得快了一些。
问老师，他让我按说明书来，同时退火温度用68°，因为他以前也用这个酶做过定点突变，就用的68°，结果都没有p出来。
很难受，这个KOD酶还比较贵，再这样下去都快被我造光了。
Pcr条件：95° 2min，95° 20s，68° 10s，70° 4min

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北极冬天

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1楼 2017-09-04 23:53:36

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北极冬天

新虫 (正式写手)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

哎呦，不好意思，看着金币就领了，专业问题给不了建议。

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8楼2017-09-04 23:55:16

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北极冬天

新虫 (正式写手)

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送红花一朵

送回去吧，哈哈

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9楼2017-09-04 23:55:59

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qqqqqq123456

至尊木虫 (职业作家)

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温度高了？

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10楼2017-09-04 23:58:39

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轩辕佑德

至尊木虫 (职业作家)

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帮顶

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13楼2017-09-05 00:26:06

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丫丫k4

禁虫 (正式写手)

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18楼2017-09-05 01:11:02

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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

★
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电泳时质粒跑的位置不一定和大小完全一致，比PCR产物跑得快或慢也正常

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19楼2017-09-05 01:26:31

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不吃M的鱼

金虫 (小有名气)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-05 07:39:46

我觉得是不是你引物设计的有问题啊？是2条引物分别是35，46吗？中间还有突变点，那你这个引物应该是短了吧？不管怎么说3端你都要有10来个碱基配对才好P。还有可以推荐用天根的一个突变试剂盒，还可以用PS酶P，只用他们那个酶消化。我一直在用，挺好用的。感兴趣可以问我。

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21楼2017-09-05 06:09:21

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598878157

版主 (文学泰斗)

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ffjd

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23楼2017-09-05 06:18:24

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sony8620

铁杆木虫 (文学泰斗)

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加油

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35楼2017-09-05 07:08:46

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geneyhh

金虫 (正式写手)

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用touchdown PCR试试

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43楼2017-09-05 08:06:17

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假大空

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好运

46楼2017-09-05 08:12:41

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梦圆20162楼

2017-09-04 23:53 回复

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北极冬天3楼

2017-09-04 23:54 回复

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sxd5832969324楼

2017-09-04 23:54 回复

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qqqqqq1234565楼

2017-09-04 23:54 回复

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努力一下下6楼

2017-09-04 23:54 回复

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21_gram7楼

2017-09-04 23:55 回复

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1802190075711楼

2017-09-04 23:59 回复

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star1991112812楼

2017-09-05 00:25 回复

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plantabiotic14楼

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撒旦先生15楼

2017-09-05 00:32 回复

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Triumph101116楼

2017-09-05 00:33 回复

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wulei14717楼

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xhmaohan20楼

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WinTey92922楼

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pandongzi24楼

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wyq17625楼

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41823628526楼

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万邦翻译27楼

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塞北先生28楼

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dongmings29楼

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youngen30楼

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koobeexia31楼

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ylheping34楼

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