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筱林士人

金虫 (著名写手)

[求助] T4酶连接试验总是失败

做T4酶连接试验总是失败,连接完之后转化到DH5α中,最后做菌液PCR总是有很多杂带,请问这是啥原因,有啥改进的方法么,请各位大神指点呀

T4酶连接试验总是失败
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luoyl210

新虫 (著名写手)

可能连接有问题,也可能是转化的问题

发自小木虫Android客户端
2楼2017-09-02 15:38:56
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luoyl210

新虫 (著名写手)

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-09-02 22:30:28
引用回帖:
3楼: Originally posted by 筱林士人 at 2017-09-02 15:54:23
请问有啥改进的办法吗...

连接之后可以用电泳检测,不过我觉得不太准,你可以试试。T4连接酶你们是有酶切位点还是没有的,如果有酶切位点的可以用酶切验证。没有就只有改进连接比例。

发自小木虫Android客户端
4楼2017-09-02 15:57:54
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匿名

用户注销 (正式写手)

本帖仅楼主可见
5楼2017-09-02 16:12:39
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能量车gogogo

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
筱林士人: 金币+20, ★有帮助 2017-09-02 17:34:46
非特异性条带或者是实验过程中污染到其他的DNA,非特异性条带可能是insert本身的问题,如果是实验过程中污染到其他的insert,就要注意实验条件了!
人不会永远十七岁,但永远有人十七岁
6楼2017-09-02 16:22:21
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cry_2013

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
T4连接要注意载体和片段的摩尔比,转化,还有细胞承受能力吧,感觉这个有时有点运气的成分在里面。。。。
7楼2017-09-02 16:22:27
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点瓣心音

木虫 (小有名气)

如果实验室使用T4 连接克隆基因的成功案列太少,完全可以换成现在的无缝连接。

发自小木虫Android客户端
8楼2017-09-02 16:51:59
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yangmeng0711

新虫 (小有名气)

双酶切也有可能是有一种酶活性低,改为单酶切,切二次

发自小木虫IOS客户端
14楼2017-09-02 18:06:20
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能量车gogogo

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 点瓣心音 at 2017-09-02 16:51:59
如果实验室使用T4 连接克隆基因的成功案列太少,完全可以换成现在的无缝连接。

请问什么叫无缝连接?
人不会永远十七岁,但永远有人十七岁
15楼2017-09-02 18:45:42
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点瓣心音

木虫 (小有名气)

具体我说得不是很详细,你可以搜索北京擎科公司、奥克等公司、宝生公司等,他们都有无缝连接产品的简介。就是在连接时,你扩增出来的目的条带两端各多了15bp左右的与载体互补的碱基序列。

发自小木虫Android客户端
16楼2017-09-03 07:36:13
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普通回帖

筱林士人

金虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by luoyl210 at 2017-09-02 15:38:56
可能连接有问题,也可能是转化的问题

请问有啥改进的办法吗
3楼2017-09-02 15:54:23
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筱林士人

金虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by luoyl210 at 2017-09-02 15:57:54
连接之后可以用电泳检测,不过我觉得不太准,你可以试试。T4连接酶你们是有酶切位点还是没有的,如果有酶切位点的可以用酶切验证。没有就只有改进连接比例。
...

我们是做了双酶切之后才做T4酶连接的,是有酶切位点的
9楼2017-09-02 17:33:39
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筱林士人

金虫 (著名写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by becklittle at 2017-09-02 16:12:39
我也遇到好多次  t4这种克隆方法确实会出很多问题  ,后来我用无缝克隆了   我感觉t4这种方法早晚会被淘汰的

我对无缝克隆不熟悉,请问是咋样做的
10楼2017-09-02 17:34:25
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