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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 测序问题
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曼陀罗爱上黑夜

新虫 (初入文坛)

[求助] 测序问题 已有5人参与

设计引物做pcr，产物电泳后条带很亮，可是为什么测序总是测不出来，测序结果总是失败？

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1楼 2017-08-24 15:23:54
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bbass533

禁虫 (小有名气)
★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-08-28 06:34:23
本帖内容被屏蔽
2楼2017-08-24 15:25:36
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yufeiwaner

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

把峰图传上来看看。
楼主测序是什么目的？
通常直接送PCR产物是很靠谱的，除非你的目标产物和非特异扩增产物大小一致，混杂了。
峰很杂很乱，那就得重新设计引物。
还有，如果你是鉴定菌种，则最好别连载体测序，因为要挑很多转化子，才能确定你的菌是单菌株。
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16楼2017-08-30 11:17:19
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luoyl210

新虫 (著名写手)
送克隆菌去测序会好一些

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3楼2017-08-24 15:37:27
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bbass533

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
5楼2017-08-24 16:48:32
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18253592055

金虫 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-08-28 06:34:51
之前有把pcr产物直接送去测序，pcr产物测序需要很高的浓度，你最好胶回收后测一下浓度，一种可能是虽然胶很亮但回收效率不高，这个除了测浓度你可以回收完取一点再跑一次胶看一下，看看亮度怎么样。另一种可能是那个条带是杂带，希望对你有帮助

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7楼2017-08-24 19:12:41
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18253592055

金虫 (正式写手)
如果是浓度太低的话，建议多p几管回收后合成一管

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8楼2017-08-24 19:13:24
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18253592055

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 曼陀罗爱上黑夜 at 2017-08-24 20:09:49
纯化我也试过了，电泳条带挺亮的，还是测不出来
...

如果这样的话那就剩下引物的问题，其实你可以连一下t载，然后用载体上的引物测一下，然后blast一下，就知道你p出来的到底是什么了。

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11楼2017-08-24 20:13:27
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姣妹崽

新虫 (小有名气)
测序的引物不要直接用PCR的引物，往内部稍微挪动几十bp再测

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12楼2017-08-26 06:35:31
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姣妹崽

新虫 (小有名气)
可以先找一个合适的酶切位点对你的片段进行初步验证一下

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13楼2017-08-26 06:36:19
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xmu_qpg

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

PCR产物的纯度，浓度都影响测序反应，测序引物可以设计在pcr产物的靠中间部分，正方向都测
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14楼2017-08-27 17:55:12
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匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见
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17楼2017-09-05 21:00:52
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草溪河

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by yufeiwaner at 2017-08-30 11:17:19
把峰图传上来看看。
楼主测序是什么目的？
通常直接送PCR产物是很靠谱的，除非你的目标产物和非特异扩增产物大小一致，混杂了。
峰很杂很乱，那就得重新设计引物。
还有，如果你是鉴定菌种，则最好别连载体测序 ...

同意该说法，并不是所有pcr产物测序都需要连载体，根据你的目的需要来确定。pcr产物测序很容易的，我们送的公司只要电泳能看见条带，基本上就能测出来，对浓度要求并不高，可能因公司而异吧。若pcr产物有非特异片段，那测序出来肯定是乱峰，这时建议连载体测序。有时复杂片段（比如高GC，富含poly结构等等）都会影响测序结果，建议测序时注明该特征。

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18楼2017-09-11 15:31:52
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草溪河

铁虫 (著名写手)
补充，我们都是直接送pcr产物测序，让公司回收的。建议和测序公司技术多沟通，了解他们的样品处理流程和测序要求。

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19楼2017-09-11 15:33:47
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普通回帖

曼陀罗爱上黑夜

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bbass533 at 2017-08-24 15:25:36
不建议送pcr产物去测序，最好是连接载体再测。不然会出现很多你想不出来的问题

原来是这样啊！可是连载体不会很麻烦吗？什么防止载体自连还有粘性末端什么的

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4楼2017-08-24 15:58:48
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曼陀罗爱上黑夜

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by bbass533 at 2017-08-24 16:48:32
买的产品化的载体，价格也不贵，而且用着放心点。如果有兴趣，你可以自己做点载体。...

嗯，好的，谢谢建议

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6楼2017-08-24 18:12:29
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曼陀罗爱上黑夜

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 18253592055 at 2017-08-24 19:12:41
之前有把pcr产物直接送去测序，pcr产物测序需要很高的浓度，你最好胶回收后测一下浓度，一种可能是虽然胶很亮但回收效率不高，这个除了测浓度你可以回收完取一点再跑一次胶看一下，看看亮度怎么样。另一种可能是那个 ...

纯化我也试过了，电泳条带挺亮的，还是测不出来

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9楼2017-08-24 20:09:49
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曼陀罗爱上黑夜

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 18253592055 at 2017-08-24 19:13:24
如果是浓度太低的话，建议多p几管回收后合成一管

浓度合格，我打算换引物了

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10楼2017-08-24 20:10:29
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