应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 测序问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
231/3返回列表123下一页
查看: 2201  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

曼陀罗爱上黑夜

新虫 (初入文坛)

[求助] 测序问题 已有5人参与

设计引物做pcr，产物电泳后条带很亮，可是为什么测序总是测不出来，测序结果总是失败？

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2017-08-24 15:23:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

bbass533

禁虫 (小有名气)
★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-08-28 06:34:23
本帖内容被屏蔽
2楼2017-08-24 15:25:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yufeiwaner

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

把峰图传上来看看。
楼主测序是什么目的？
通常直接送PCR产物是很靠谱的，除非你的目标产物和非特异扩增产物大小一致，混杂了。
峰很杂很乱，那就得重新设计引物。
还有，如果你是鉴定菌种，则最好别连载体测序，因为要挑很多转化子，才能确定你的菌是单菌株。
赞一下(3人) 回复此楼
16楼2017-08-30 11:17:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luoyl210

新虫 (著名写手)
送克隆菌去测序会好一些

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2017-08-24 15:37:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bbass533

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
5楼2017-08-24 16:48:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18253592055

金虫 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-08-28 06:34:51
之前有把pcr产物直接送去测序，pcr产物测序需要很高的浓度，你最好胶回收后测一下浓度，一种可能是虽然胶很亮但回收效率不高，这个除了测浓度你可以回收完取一点再跑一次胶看一下，看看亮度怎么样。另一种可能是那个条带是杂带，希望对你有帮助

发自小木虫IOS客户端
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2017-08-24 19:12:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18253592055

金虫 (正式写手)
如果是浓度太低的话，建议多p几管回收后合成一管

发自小木虫IOS客户端
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2017-08-24 19:13:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18253592055

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 曼陀罗爱上黑夜 at 2017-08-24 20:09:49
纯化我也试过了，电泳条带挺亮的，还是测不出来
...

如果这样的话那就剩下引物的问题，其实你可以连一下t载，然后用载体上的引物测一下，然后blast一下，就知道你p出来的到底是什么了。

发自小木虫IOS客户端
赞一下(1人) 回复此楼
11楼2017-08-24 20:13:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

姣妹崽

新虫 (小有名气)
测序的引物不要直接用PCR的引物，往内部稍微挪动几十bp再测

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2017-08-26 06:35:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

姣妹崽

新虫 (小有名气)
可以先找一个合适的酶切位点对你的片段进行初步验证一下

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
13楼2017-08-26 06:36:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmu_qpg

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

PCR产物的纯度，浓度都影响测序反应，测序引物可以设计在pcr产物的靠中间部分，正方向都测
赞一下(1人) 回复此楼
14楼2017-08-27 17:55:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见
赞一下
17楼2017-09-05 21:00:52
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

草溪河

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by yufeiwaner at 2017-08-30 11:17:19
把峰图传上来看看。
楼主测序是什么目的？
通常直接送PCR产物是很靠谱的，除非你的目标产物和非特异扩增产物大小一致，混杂了。
峰很杂很乱，那就得重新设计引物。
还有，如果你是鉴定菌种，则最好别连载体测序 ...

同意该说法，并不是所有pcr产物测序都需要连载体，根据你的目的需要来确定。pcr产物测序很容易的，我们送的公司只要电泳能看见条带，基本上就能测出来，对浓度要求并不高，可能因公司而异吧。若pcr产物有非特异片段，那测序出来肯定是乱峰，这时建议连载体测序。有时复杂片段（比如高GC，富含poly结构等等）都会影响测序结果，建议测序时注明该特征。

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
18楼2017-09-11 15:31:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

草溪河

铁虫 (著名写手)
补充，我们都是直接送pcr产物测序，让公司回收的。建议和测序公司技术多沟通，了解他们的样品处理流程和测序要求。

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
19楼2017-09-11 15:33:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

曼陀罗爱上黑夜

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bbass533 at 2017-08-24 15:25:36
不建议送pcr产物去测序，最好是连接载体再测。不然会出现很多你想不出来的问题

原来是这样啊！可是连载体不会很麻烦吗？什么防止载体自连还有粘性末端什么的

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
4楼2017-08-24 15:58:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

曼陀罗爱上黑夜

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by bbass533 at 2017-08-24 16:48:32
买的产品化的载体，价格也不贵，而且用着放心点。如果有兴趣，你可以自己做点载体。...

嗯，好的，谢谢建议

发自小木虫Android客户端
回复此楼
6楼2017-08-24 18:12:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

曼陀罗爱上黑夜

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 18253592055 at 2017-08-24 19:12:41
之前有把pcr产物直接送去测序，pcr产物测序需要很高的浓度，你最好胶回收后测一下浓度，一种可能是虽然胶很亮但回收效率不高，这个除了测浓度你可以回收完取一点再跑一次胶看一下，看看亮度怎么样。另一种可能是那个 ...

纯化我也试过了，电泳条带挺亮的，还是测不出来

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
9楼2017-08-24 20:09:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

曼陀罗爱上黑夜

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 18253592055 at 2017-08-24 19:13:24
如果是浓度太低的话，建议多p几管回收后合成一管

浓度合格，我打算换引物了

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
10楼2017-08-24 20:10:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 曼陀罗爱上黑夜 的主题更新
231/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿北京化工大学材料与化工（085600）296求调剂 +19 稻妻小编 2026-03-26 19/950 2026-03-30 14:49 by maolC
[考研] 一志愿南航 335分 | 0856材料化工 | GPA 4.07 | 有科研经历 +8 cccchenso 2026-03-23 8/400 2026-03-30 14:14 by w虫虫123
[考研] 287求调剂 +11 land xuxu 2026-03-26 11/550 2026-03-30 13:17 by 白云朵朵飞
[考研] 求调剂 +7 青春裁为三截 2026-03-29 7/350 2026-03-30 13:14 by laoshidan
[考研] 300求调剂，材料科学英一数二 +16 leaflight 2026-03-24 16/800 2026-03-30 13:00 by 1939136013狗壮
[考研] 0703一志愿9，初试成绩：338，四六级已过，有科研经历，求调剂！ +5 Zuhui0306 2026-03-25 5/250 2026-03-30 10:27 by herarysara
[考研] 一志愿武汉理工，总分321，英一数二，求老师收留。 +11 nnnnnnn5 2026-03-25 11/550 2026-03-29 20:42 by 无际的草原
[考研] 305求调剂 +8 RuiFairyrui 2026-03-28 8/400 2026-03-29 08:22 by fmesaito
[考研] 083000学硕274求调剂 +8 Li李鱼 2026-03-26 8/400 2026-03-28 20:33 by 加油向未来啊
[考研] 压国家一区线，求导师收留，有恩必谢！ +7 迷人的哈哈 2026-03-28 7/350 2026-03-28 16:47 by 催化大白
[考研] 317求调剂 +6 十闲wx 2026-03-24 6/300 2026-03-28 13:27 by Iveryant
[考研] 086000调剂 +3 7901117076 2026-03-26 3/150 2026-03-27 21:34 by Jianing_Mi
[考研] 265求调剂11408 +3 刘小鹿lu 2026-03-27 3/150 2026-03-27 20:53 by nihaoar
[考研] 266分求材料化工冶金矿业等专业的调剂 +4 哇呼哼呼哼 2026-03-26 4/200 2026-03-27 17:02 by zhyzzh
[考研] 调剂 +3 李嘉图·S·路 2026-03-27 3/150 2026-03-27 11:19 by wangjy2002
[考研] 考研调剂 +9 小蜡新笔 2026-03-26 9/450 2026-03-27 11:10 by 不吃魚的貓
[考研] 一志愿吉大071010，316分求调剂 +3 xgbiknn 2026-03-27 3/150 2026-03-27 10:36 by guoweigw
[考研] 303求调剂 +6 蓝山月 2026-03-25 6/300 2026-03-25 22:47 by 418490947
[考研] 化工专硕求调剂 +3 question挽风 2026-03-24 3/150 2026-03-24 18:48 by jhhcooi
[考研] 一志愿吉大化学322求调剂 +4 17501029541 2026-03-23 6/300 2026-03-24 10:21 by 戴围脖的小蚊子
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭