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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » EMSA/ChIP » 关于Western blot背景太脏的问题
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yandalan

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于Western blot背景太脏的问题 已有7人参与

组织蛋白，总上样量为40ug，用10%的胶，60v电泳浓缩胶，80v电泳分离胶，200mA转膜2小时，之后5%脱脂奶粉封闭2小时，一抗以一抗稀释液1：1000稀释，因为没有4℃冰柜，以前都是一抗在垂直混悬仪孵育过夜，第二天以1XTBST洗条带5min6次，二抗1：2000孵育2小时，1XTBST洗带条5min6次后用高敏曝光剂曝光，如下图，之后改变了很多次条件，包括一抗敷育时间减少到常温4小时，稀释一抗至1：10000，二抗稀释至1：10000等，结果都是一样，求助！万分感谢！

关于Western blot背景太脏的问题


关于Western blot背景太脏的问题-1


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1楼 2017-07-30 14:32:46
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★
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室温2 h内就够了，如果抗体特异性不好，回收使用的抗体效果更好。
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2楼2017-08-02 10:41:24
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knighthan112

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不要用脱脂奶粉 用牛血清白蛋白试试。
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3楼2017-08-04 17:17:52
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最爱琪琪

新虫 (小有名气)
★
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抗体可以用牛奶配试一下

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4楼2017-08-04 21:11:39
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xiao2189818

金虫 (正式写手)
★
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给你个建议 37度温箱2h 尽量让一抗覆盖住pvdf膜 然后 拿出来洗脱3次 弄2抗2h 完了后泡到tbst中 第二天拿出来曝光就行 其实我做了好久 感觉做完直接曝光最好 你这个洗脱不要少 能保存到4度是最好的

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5楼2017-08-04 22:26:43
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xiao2189818

金虫 (正式写手)
你没发现你的背景有问题吗 还有一点你的目的蛋白多大 你用的多大孔的膜 一抗 二抗是不同属的吗

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6楼2017-08-04 22:27:46
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极北小白熊

铁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
缩短1抗时间，更改封闭液组份并延长时间，缩短二抗时间，加大稀释比例，几步漂洗液更换一下，更改一下离子浓度，，western 就是一个摸索的过程，不要急

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7楼2017-08-05 09:31:07
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学药的孩纸

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的抗体特异性好嘛，之前做出来过比较清楚的背景吗

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8楼2017-08-05 18:13:47
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13163896856

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
明显是抗体不好，特异性差

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9楼2017-08-05 18:39:58
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