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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » EMSA/ChIP » 关于Western blot背景太脏的问题
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yandalan

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于Western blot背景太脏的问题 已有7人参与

组织蛋白，总上样量为40ug，用10%的胶，60v电泳浓缩胶，80v电泳分离胶，200mA转膜2小时，之后5%脱脂奶粉封闭2小时，一抗以一抗稀释液1：1000稀释，因为没有4℃冰柜，以前都是一抗在垂直混悬仪孵育过夜，第二天以1XTBST洗条带5min6次，二抗1：2000孵育2小时，1XTBST洗带条5min6次后用高敏曝光剂曝光，如下图，之后改变了很多次条件，包括一抗敷育时间减少到常温4小时，稀释一抗至1：10000，二抗稀释至1：10000等，结果都是一样，求助！万分感谢！

关于Western blot背景太脏的问题


关于Western blot背景太脏的问题-1


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1楼 2017-07-30 14:32:46
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极北小白熊

铁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
缩短1抗时间，更改封闭液组份并延长时间，缩短二抗时间，加大稀释比例，几步漂洗液更换一下，更改一下离子浓度，，western 就是一个摸索的过程，不要急

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7楼2017-08-05 09:31:07
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
室温2 h内就够了，如果抗体特异性不好，回收使用的抗体效果更好。
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2楼2017-08-02 10:41:24
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knighthan112

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不要用脱脂奶粉 用牛血清白蛋白试试。
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3楼2017-08-04 17:17:52
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最爱琪琪

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
抗体可以用牛奶配试一下

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4楼2017-08-04 21:11:39
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