应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增约6000bp质粒，一直失败
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 4857  |  回复: 19
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

钱塘幼麟

木虫 (著名写手)

[求助] PCR扩增约6000bp质粒，一直失败 已有7人参与

准备用Gibson Assembly Mix把一个片段插入一个质粒，所以在这个操作前，先用PCR把同源臂扩入这个质粒。质粒全长6000bp多。PCR中，使用Q5-HF， 25微升推荐的体系。正向引物TM59.2. 反向引物TM54.2。程序如下：98度30秒， 98度30秒，50-58度梯度7分，72度30秒，72度10分，6度无限长hold。

最后扩增出来的条带图如下：全部积在槽子里。不知道怎么回事，求指点。

PCR扩增约6000bp质粒，一直失败
ChemiDoc MP 2017-06-29 13hr 35min(new linker primers for 1b and 2b vector).jpg
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2017-06-29 17:52:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

狗屎运

新虫 (小有名气)
退火时间有问题吧

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2017-06-30 09:49:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 20 个回答

伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-29 22:46:20
钱塘幼麟: 金币+5, ★有帮助 2017-08-04 17:23:43
没用过Gibson Assembly Mix这个试剂盒。我一般是把载体单酶切或双酶切，然后和两端带有同源序列的PCR产物进行Gibson cloning。如果你是用PCR方法扩增质粒的话，注意你的引物，看看有没有问题。还有就是，你用质粒做模板的话，只需要加几ng的质粒就够了，不需要太多。
赞一下(2人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

钱塘幼麟
对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
2楼2017-06-29 20:33:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-06-29 20:33:09
没用过Gibson Assembly Mix这个试剂盒。我一般是把载体单酶切或双酶切，然后和两端带有同源序列的PCR产物进行Gibson cloning。如果你是用PCR方法扩增质粒的话，注意你的引物，看看有没有问题。还有就是，你用质粒做 ...

质粒提取浓度是300多ng每微升，加了0.25微升。

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
3楼2017-06-30 08:56:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

demonhb

新虫 (小有名气)
程序错了吧，怎么会退火时间7分钟，而延伸时间才30秒，反了吧，你这酶不可能30秒能延伸6000bp吧

发自小木虫Android客户端
赞一下(3人) 回复此楼
4楼2017-06-30 09:22:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 20 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085602化工求调剂（331分） +8 111@127 2026-03-30 8/400 2026-03-30 21:23 by 研究僧导导
[考研] 307求调剂 +17 超级伊昂大王 2026-03-24 18/900 2026-03-30 21:22 by dick_runner
[考研] 083000学硕274求调剂 +9 Li李鱼 2026-03-26 9/450 2026-03-30 21:06 by dophin1985
[考研] 11408总分309，一志愿东南大学求调剂，不挑专业 +5 天赋带到THU 2026-03-29 6/300 2026-03-30 20:49 by dick_runner
[考研] 289求调剂 +16 新时代材料 2026-03-27 16/800 2026-03-30 19:04 by Wang200018
[考研] 求调剂323材料与化工 +10 1124361 2026-03-24 10/500 2026-03-30 16:26 by 690616278
[考研] 11408软件工程求调剂 +3 Qiu学ing 2026-03-28 3/150 2026-03-28 21:50 by zhq0425
[考研] 315求调剂 +4 akie... 2026-03-28 5/250 2026-03-28 21:05 by zhq0425
[考研] 一志愿厦门大学化学学硕307求调剂 +10 y7czhao 2026-03-26 10/500 2026-03-28 14:23 by 唐沐儿
[考研] 347求调剂 +3 山顶见α 2026-03-25 3/150 2026-03-28 14:13 by 唐沐儿
[考研] 070300求调剂306分 +4 26要上岸 2026-03-27 4/200 2026-03-28 13:06 by 唐沐儿
[考研] 266分，求材料冶金能源化工等调剂 +7 哇呼哼呼哼 2026-03-27 9/450 2026-03-28 12:22 by zllcz
[考研] 339求调剂，想调回江苏 +6 烤麦芽 2026-03-27 8/400 2026-03-28 10:40 by 烤麦芽
[考研] 352分 化工与材料 +5 海纳百川Ly 2026-03-27 5/250 2026-03-28 03:39 by fmesaito
[考研] 285求调剂 +4 AZMK 2026-03-27 7/350 2026-03-27 20:59 by AZMK
[考研] 一志愿上海理工能源动力（085800）310分求调剂 +3 zhangmingc 2026-03-27 4/200 2026-03-27 19:01 by 给你你注意休息
[考研] 化学调剂 +4 爱吃番茄的旭 2026-03-24 5/250 2026-03-27 17:50 by kiokin
[考研] 材料求调剂 +5 .m.. 2026-03-25 5/250 2026-03-27 11:08 by 不吃魚的貓
[考研] 求调剂 +6 林之夕 2026-03-24 6/300 2026-03-27 08:38 by hypershenger
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +4 崔wj 2026-03-26 4/200 2026-03-27 08:04 by chemisry
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭