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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增约6000bp质粒，一直失败
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)

[求助] PCR扩增约6000bp质粒，一直失败 已有7人参与

准备用Gibson Assembly Mix把一个片段插入一个质粒，所以在这个操作前，先用PCR把同源臂扩入这个质粒。质粒全长6000bp多。PCR中，使用Q5-HF， 25微升推荐的体系。正向引物TM59.2. 反向引物TM54.2。程序如下：98度30秒， 98度30秒，50-58度梯度7分，72度30秒，72度10分，6度无限长hold。

最后扩增出来的条带图如下：全部积在槽子里。不知道怎么回事，求指点。

PCR扩增约6000bp质粒，一直失败
ChemiDoc MP 2017-06-29 13hr 35min(new linker primers for 1b and 2b vector).jpg
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1楼 2017-06-29 17:52:55
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

demonhb

新虫 (小有名气)
程序错了吧，怎么会退火时间7分钟，而延伸时间才30秒，反了吧，你这酶不可能30秒能延伸6000bp吧

发自小木虫Android客户端
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4楼2017-06-30 09:22:45
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-29 22:46:20
钱塘幼麟: 金币+5, ★有帮助 2017-08-04 17:23:43
没用过Gibson Assembly Mix这个试剂盒。我一般是把载体单酶切或双酶切，然后和两端带有同源序列的PCR产物进行Gibson cloning。如果你是用PCR方法扩增质粒的话，注意你的引物，看看有没有问题。还有就是，你用质粒做模板的话，只需要加几ng的质粒就够了，不需要太多。
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钱塘幼麟
对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
2楼2017-06-29 20:33:09
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cuijiaqi_92

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
延伸时间：一般为1kb,1min
建议增长延伸时间
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山阴路的夏天
7楼2017-06-30 17:03:40
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stabilized

银虫 (小有名气)
72度时间太短，增长延伸时间
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坚持！
8楼2017-06-30 17:28:00
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冯丽妍fly

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
退火和延伸的时间是不是弄反了？延伸的时间1kb 1min，退火时间为30s.
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9楼2017-06-30 19:53:01
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安静过生活

银虫 (初入文坛)
一是退火延伸时间反了，二是如果你片段比较短，可以把重组臂扩在片段上，短的片段总比长的质粒好扩。

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10楼2017-07-01 12:36:15
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狗屎运

新虫 (小有名气)
退火时间有问题吧

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5楼2017-06-30 09:49:42
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拿下英语

金虫 (著名写手)
6000太长，分两段扩

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11楼2017-07-01 13:04:43
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by demonhb at 2017-06-30 09:22:45
程序错了吧，怎么会退火时间7分钟，而延伸时间才30秒，反了吧，你这酶不可能30秒能延伸6000bp吧

对，我打错了。延伸时间7分钟，退火30秒。
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12楼2017-07-27 09:51:23
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匿名

用户注销 (正式写手)
本帖仅楼主可见
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16楼2017-08-30 11:51:03
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hua_geduo

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

首先你的片段6000，所用的酶或Mix可以不可以支持这么长片段的PCR反应，其次，你的程序设置错误，退货温度7分钟，延伸时间30秒，设反了吧？
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17楼2017-08-31 15:53:58
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普通回帖

钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-06-29 20:33:09
没用过Gibson Assembly Mix这个试剂盒。我一般是把载体单酶切或双酶切，然后和两端带有同源序列的PCR产物进行Gibson cloning。如果你是用PCR方法扩增质粒的话，注意你的引物，看看有没有问题。还有就是，你用质粒做 ...

质粒提取浓度是300多ng每微升，加了0.25微升。

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3楼2017-06-30 08:56:24
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白话八股

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
98度30秒，50-58度梯度7分，72度30秒---这是退火时间和延伸时间反了吧？
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最爱的那个人会出现在身边。
6楼2017-06-30 16:11:17
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