应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增约6000bp质粒，一直失败
51/1返回列表
查看: 5187  |  回复: 19
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

钱塘幼麟

木虫 (著名写手)

[求助] PCR扩增约6000bp质粒，一直失败 已有7人参与

准备用Gibson Assembly Mix把一个片段插入一个质粒，所以在这个操作前，先用PCR把同源臂扩入这个质粒。质粒全长6000bp多。PCR中，使用Q5-HF， 25微升推荐的体系。正向引物TM59.2. 反向引物TM54.2。程序如下：98度30秒， 98度30秒，50-58度梯度7分，72度30秒，72度10分，6度无限长hold。

最后扩增出来的条带图如下：全部积在槽子里。不知道怎么回事，求指点。

PCR扩增约6000bp质粒，一直失败
ChemiDoc MP 2017-06-29 13hr 35min(new linker primers for 1b and 2b vector).jpg
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2017-06-29 17:52:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stabilized

银虫 (小有名气)
72度时间太短，增长延伸时间
赞一下(2人) 回复此楼
坚持！
8楼2017-06-30 17:28:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 20 个回答

伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-29 22:46:20
钱塘幼麟: 金币+5, ★有帮助 2017-08-04 17:23:43
没用过Gibson Assembly Mix这个试剂盒。我一般是把载体单酶切或双酶切，然后和两端带有同源序列的PCR产物进行Gibson cloning。如果你是用PCR方法扩增质粒的话，注意你的引物，看看有没有问题。还有就是，你用质粒做模板的话，只需要加几ng的质粒就够了，不需要太多。
赞一下(2人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

钱塘幼麟
对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
2楼2017-06-29 20:33:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-06-29 20:33:09
没用过Gibson Assembly Mix这个试剂盒。我一般是把载体单酶切或双酶切，然后和两端带有同源序列的PCR产物进行Gibson cloning。如果你是用PCR方法扩增质粒的话，注意你的引物，看看有没有问题。还有就是，你用质粒做 ...

质粒提取浓度是300多ng每微升，加了0.25微升。

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
3楼2017-06-30 08:56:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

demonhb

新虫 (小有名气)
程序错了吧，怎么会退火时间7分钟，而延伸时间才30秒，反了吧，你这酶不可能30秒能延伸6000bp吧

发自小木虫Android客户端
赞一下(3人) 回复此楼
4楼2017-06-30 09:22:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 20 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +13 Kittylucky 2026-08-27 14/700 2026-09-01 11:06 by feng6531
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +6 叶九微 2026-08-26 6/300 2026-08-31 23:54 by yudaoqian88
[基金申请] 国社科又开始会评了，不知道这次命运如何 +7 雨打竹帘 2026-08-30 11/550 2026-08-31 23:16 by hittle2008
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +17 爱看书的可乐 2026-08-26 19/950 2026-08-31 21:30 by xiangy672
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +6 yuleib84 2026-08-26 7/350 2026-08-31 19:46 by 鱼翔浅底1
[基金申请] 面上意见出来了 +12 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 23/1150 2026-08-31 18:57 by 黄鸟于飞Chao
[基金申请] 能否申诉？ +7 echo8914667 2026-08-30 8/400 2026-08-31 17:00 by yihongxu
[文学芳草园] 梦想 +5 myrtle 2026-08-26 5/250 2026-08-31 14:40 by hahaboy
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +7 349506619 2026-08-28 7/350 2026-08-31 13:39 by 冼亮淀粉酶
[基金申请] 29号明天会评吗 +4 笨笨唐 2026-08-28 4/200 2026-08-31 09:30 by huixian257
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +15 晴天加油 2026-08-26 16/800 2026-08-29 18:28 by symmetry
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭