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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增约6000bp质粒，一直失败
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拿下英语

金虫 (著名写手)
6000太长，分两段扩

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11楼2017-07-01 13:04:43
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by demonhb at 2017-06-30 09:22:45
程序错了吧，怎么会退火时间7分钟，而延伸时间才30秒，反了吧，你这酶不可能30秒能延伸6000bp吧

对，我打错了。延伸时间7分钟，退火30秒。
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12楼2017-07-27 09:51:23
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钱塘幼麟

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-06-29 20:33:09
没用过Gibson Assembly Mix这个试剂盒。我一般是把载体单酶切或双酶切，然后和两端带有同源序列的PCR产物进行Gibson cloning。如果你是用PCR方法扩增质粒的话，注意你的引物，看看有没有问题。还有就是，你用质粒做 ...

请问：在用Gibson Assembly 之前，是不是要把载体质粒先切开？
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13楼2017-07-27 09:53:00
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wallee

新虫 (初入文坛)
仔细看说明书

发自小木虫IOS客户端
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14楼2017-07-27 16:17:21
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伤何处

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 钱塘幼麟 at 2017-07-27 09:53:00
请问：在用Gibson Assembly 之前，是不是要把载体质粒先切开？...

有两种方法把载体线性化，一种是酶切切开，另外一种是PCR扩增。载体酶切用的多一些，因为不涉及PCR的错配之类的。
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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
15楼2017-07-27 23:55:19
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匿名

用户注销 (正式写手)
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16楼2017-08-30 11:51:03
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hua_geduo

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

首先你的片段6000，所用的酶或Mix可以不可以支持这么长片段的PCR反应，其次，你的程序设置错误，退货温度7分钟，延伸时间30秒，设反了吧？
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17楼2017-08-31 15:53:58
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生煎包煎饺

新虫 (正式写手)
金币

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18楼2018-02-10 12:17:41
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沈点钱好吗

禁虫 (初入文坛)
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19楼2018-05-31 23:21:28
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练练练链球菌

新虫 (小有名气)
楼主 最后这个问题解决了吗

发自小木虫IOS客户端
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20楼2022-03-19 14:54:06
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