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xmcw765

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助分子克隆 已有1人参与

最近做分子克隆,pet28a的载体,我用的是nde1和xho1两个酶切位点,菌液pcr全部是阳性,但双酶切后就是没有插入片段,请教,是否要换酶切位点?是不是pet28a载体的xhoI不好用呢

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jerry110

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by xmcw765 at 2017-06-27 23:40:42
我是20ul体系切1ng,我也认为是载体没切开,但我不知道是不是这个载体上酶切位点的问题,因为其他载体我用同样的体系都没问题,不知道你有用过28a上同样的酶切位点吗?
...

酶都是常用的酶,没有问题,我认为载体浓度高本身切的就会不好,此外基因片段是pcr产物比载体难切,片段切的不好也会出现验证假阳性,你可以参考一下酶的说明书,祝好!

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8楼2017-06-28 16:44:39
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fengshen2005

银虫 (正式写手)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-25 09:32:40
菌液PCR假阳性很高(你的片段不管是否连入载体,仍然被你铺在平板上,你挑点菌斑以外的培养基都能P出你的条带),能长出斑说明你载体没切好

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2楼2017-06-25 05:49:08
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
切不出来,你就送几个样去测序确定下到底插入没。如果测序有结果的话,看看酶切位点有变化没。没变化的话,可能就是你酶的问题。或者你酶切的时候,再拿空载作对照一起酶切,看看能不能切开
对也罢,错也罢;正也罢,逆也罢;通途也好,崎岖无妨……但问,吾心坚否?若坚,纵使歧路,以铁心,贯穿而过,亦为大道!不坚,便是坦途,也难登临绝顶,观险峰
3楼2017-06-25 13:43:12
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xmcw765

新虫 (初入文坛)

测序发现是空载,明天做单酶切验证载体

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4楼2017-06-26 01:06:23
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