应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助分子克隆
141/2返回列表12下一页
查看: 2100  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xmcw765

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助分子克隆 已有1人参与

最近做分子克隆，pet28a的载体，我用的是nde1和xho1两个酶切位点，菌液pcr全部是阳性，但双酶切后就是没有插入片段，请教，是否要换酶切位点？是不是pet28a载体的xhoI不好用呢

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2017-06-25 00:01:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

fengshen2005

银虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-25 09:32:40
菌液PCR假阳性很高（你的片段不管是否连入载体，仍然被你铺在平板上，你挑点菌斑以外的培养基都能P出你的条带），能长出斑说明你载体没切好

发自小木虫Android客户端
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2017-06-25 05:49:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
切不出来，你就送几个样去测序确定下到底插入没。如果测序有结果的话，看看酶切位点有变化没。没变化的话，可能就是你酶的问题。或者你酶切的时候，再拿空载作对照一起酶切，看看能不能切开
赞一下(2人) 回复此楼
对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
3楼2017-06-25 13:43:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jerry110

新虫 (小有名气)
载体和基因片段片段酶切不完全也会出现很多假阳性，酶切时间稍微延长，载体酶切完回收前加一个叫做去磷酸化的酶，防止载体自身环化，此外根据我的经验，载体和基因片段50uL体系，切大约1ng就够了，祝好！
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2017-06-27 16:12:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jerry110

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xmcw765 at 2017-06-27 23:40:42
我是20ul体系切1ng，我也认为是载体没切开，但我不知道是不是这个载体上酶切位点的问题，因为其他载体我用同样的体系都没问题，不知道你有用过28a上同样的酶切位点吗？
...

酶都是常用的酶，没有问题，我认为载体浓度高本身切的就会不好，此外基因片段是pcr产物比载体难切，片段切的不好也会出现验证假阳性，你可以参考一下酶的说明书，祝好！
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

xmcw765
8楼2017-06-28 16:44:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

xmcw765

新虫 (初入文坛)
测序发现是空载，明天做单酶切验证载体

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
4楼2017-06-26 01:06:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

不明非

新虫 (初入文坛)
阴性对照呢?
回复此楼
6楼2017-06-27 16:17:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmcw765

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jerry110 at 2017-06-27 16:12:30
载体和基因片段片段酶切不完全也会出现很多假阳性，酶切时间稍微延长，载体酶切完回收前加一个叫做去磷酸化的酶，防止载体自身环化，此外根据我的经验，载体和基因片段50uL体系，切大约1ng就够了，祝好！

我是20ul体系切1ng，我也认为是载体没切开，但我不知道是不是这个载体上酶切位点的问题，因为其他载体我用同样的体系都没问题，不知道你有用过28a上同样的酶切位点吗？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
7楼2017-06-27 23:40:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmcw765

新虫 (初入文坛)
问题已解决，感谢各位大神 膜拜一下

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
9楼2017-06-30 08:07:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmcw765

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by jerry110 at 2017-06-28 16:44:39
酶都是常用的酶，没有问题，我认为载体浓度高本身切的就会不好，此外基因片段是pcr产物比载体难切，片段切的不好也会出现验证假阳性，你可以参考一下酶的说明书，祝好！...

非常感谢，问题解决了，已经构建出来了

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
10楼2017-06-30 08:09:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xmcw765 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 289求调剂 +8 硕星赴 2026-03-23 8/400 2026-03-24 20:17 by peike
[有机交流] 有机合成求助 20+3 FENGSHUJEI 2026-03-23 5/250 2026-03-24 19:31 by 88817753
[考研] 化工专硕求调剂 +3 question挽风 2026-03-24 3/150 2026-03-24 18:48 by jhhcooi
[考研] 070300化学求调剂 +9 苑豆豆 2026-03-20 9/450 2026-03-24 17:15 by licg0208
[考研] 材料与化工328分调剂 +4 。，。，。，。i 2026-03-23 4/200 2026-03-24 11:03 by 544594351
[考研] 279分求调剂 一志愿211 +18 chaojifeixia 2026-03-19 20/1000 2026-03-24 10:34 by dolphin_ycj
[基金申请] 请教下大家 2026年国家基金申请是双盲审吗？ +3 lishucheng1 2026-03-22 5/250 2026-03-24 08:22 by gltch
[考研] 求材料，环境专业调剂 +3 18567500178 2026-03-18 3/150 2026-03-23 23:50 by 热情沙漠
[考研] 工科0856求调剂 +5 沐析汀汀 2026-03-21 5/250 2026-03-23 17:56 by 海瑟薇-
[考研] 352求调剂 +3 大米饭！ 2026-03-22 3/150 2026-03-22 23:28 by king123！
[考研] 生物学调剂 +5 Surekei 2026-03-21 5/250 2026-03-22 14:39 by tcx007
[考研] 286求调剂 +10 Faune 2026-03-21 10/500 2026-03-21 23:34 by 314126402
[考研] 材料求调剂 +5 @taotao 2026-03-21 5/250 2026-03-21 20:55 by lbsjt
[考研] 311求调剂 +3 勇敢的小吴 2026-03-20 3/150 2026-03-21 17:40 by ColorlessPI
[考研] 265求调剂 +12 梁梁校校 2026-03-19 14/700 2026-03-21 13:38 by lature00
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-03-18 6/300 2026-03-21 00:32 by JourneyLucky
[考研] 一志愿苏州大学材料求调剂，总分315（英一） +5 sbdksD 2026-03-19 5/250 2026-03-20 22:10 by luoyongfeng
[考研] 材料学硕297已过四六级求调剂推荐 +11 adaie 2026-03-19 11/550 2026-03-20 21:30 by laoshidan
[考研] 295复试调剂 +8 简木ChuFront 2026-03-19 8/400 2026-03-20 20:44 by zhukairuo
[考研] 261求B区调剂，科研经历丰富 +3 牛奶很忙 2026-03-20 4/200 2026-03-20 19:34 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭