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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助分子克隆
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xmcw765

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助分子克隆 已有1人参与

最近做分子克隆，pet28a的载体，我用的是nde1和xho1两个酶切位点，菌液pcr全部是阳性，但双酶切后就是没有插入片段，请教，是否要换酶切位点？是不是pet28a载体的xhoI不好用呢

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1楼 2017-06-25 00:01:56
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

fengshen2005

银虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-06-25 09:32:40
菌液PCR假阳性很高（你的片段不管是否连入载体，仍然被你铺在平板上，你挑点菌斑以外的培养基都能P出你的条带），能长出斑说明你载体没切好

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2楼2017-06-25 05:49:08
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
切不出来，你就送几个样去测序确定下到底插入没。如果测序有结果的话，看看酶切位点有变化没。没变化的话，可能就是你酶的问题。或者你酶切的时候，再拿空载作对照一起酶切，看看能不能切开
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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
3楼2017-06-25 13:43:12
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jerry110

新虫 (小有名气)
载体和基因片段片段酶切不完全也会出现很多假阳性，酶切时间稍微延长，载体酶切完回收前加一个叫做去磷酸化的酶，防止载体自身环化，此外根据我的经验，载体和基因片段50uL体系，切大约1ng就够了，祝好！
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5楼2017-06-27 16:12:30
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jerry110

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xmcw765 at 2017-06-27 23:40:42
我是20ul体系切1ng，我也认为是载体没切开，但我不知道是不是这个载体上酶切位点的问题，因为其他载体我用同样的体系都没问题，不知道你有用过28a上同样的酶切位点吗？
...

酶都是常用的酶，没有问题，我认为载体浓度高本身切的就会不好，此外基因片段是pcr产物比载体难切，片段切的不好也会出现验证假阳性，你可以参考一下酶的说明书，祝好！
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xmcw765
8楼2017-06-28 16:44:39
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普通回帖

xmcw765

新虫 (初入文坛)
测序发现是空载，明天做单酶切验证载体

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4楼2017-06-26 01:06:23
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不明非

新虫 (初入文坛)
阴性对照呢?
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6楼2017-06-27 16:17:00
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xmcw765

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jerry110 at 2017-06-27 16:12:30
载体和基因片段片段酶切不完全也会出现很多假阳性，酶切时间稍微延长，载体酶切完回收前加一个叫做去磷酸化的酶，防止载体自身环化，此外根据我的经验，载体和基因片段50uL体系，切大约1ng就够了，祝好！

我是20ul体系切1ng，我也认为是载体没切开，但我不知道是不是这个载体上酶切位点的问题，因为其他载体我用同样的体系都没问题，不知道你有用过28a上同样的酶切位点吗？

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7楼2017-06-27 23:40:42
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xmcw765

新虫 (初入文坛)
问题已解决，感谢各位大神 膜拜一下

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9楼2017-06-30 08:07:21
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xmcw765

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by jerry110 at 2017-06-28 16:44:39
酶都是常用的酶，没有问题，我认为载体浓度高本身切的就会不好，此外基因片段是pcr产物比载体难切，片段切的不好也会出现验证假阳性，你可以参考一下酶的说明书，祝好！...

非常感谢，问题解决了，已经构建出来了

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10楼2017-06-30 08:09:14
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